DNA重組（DNArecombination）技術：外源基因的蛋白表達3

（6）遺傳標記： 從成千上萬個哺乳細胞中，檢測出極少數的含DNA重組體的轉染細胞，并鑒定已導入外源DNA是哺乳動物細胞基因表達系統的一個關鍵內容。因此，在真核生物表達載體上必須附有標記基因，才能進行篩選。常用的標記基因有：胸苷激酶基因（thymidine kinase，TK）、二氫葉酸還原酶基因（dihydrofolate reductase，DHFR）、氯霉素乙酰轉移酶基因（chloramphenicol acetyltransferase,CAT）、新霉素抗性基因（neomycin resistance,NEO）等。

例如新霉素是細菌的抗生素，它可以干擾原核生物的核糖體，使蛋白質合成不能正常進行，而真核細胞核糖體不受新霉素的影響。新霉素的一種類似物G418對真核細胞和原核細胞均有毒性。細菌的新霉素抗性基因與能有效轉錄的真核DNA序列連鎖時，就能在真核細胞中獲得有效的表達。NEO基因編碼的磷酸轉移酶能使G418失活。所以，當細胞表達了這種NEO抗性基因以后就會在含有G418的選擇培養基中存活，這種選擇系統適用于所有的細胞類型。

2.常用的外源基因轉染哺乳動物細胞的方式

常用的外源基因轉染哺乳動物細胞的方式有許多。

不同哺乳動物細胞轉染方式及應用

3.哺乳動物細胞的瞬時表達和穩定表達系統

在哺乳動物細胞表達系統中比較具有代表性的是COS細胞瞬時表達系統和中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster overy cell，CHO）的穩定表達系統。 (1)COS細胞瞬時表達系統： 由COS細胞系和帶有SV40復制起始點（SV40 ori）的表達載體組成的。

SV40病毒染宿主細胞后，SV40病毒的早期基因產物—大T抗原作為反式因子與SV40 ori 結合，使宿主細胞的DNA聚合酶不斷復制病毒DNA，最后的結果是在宿主細胞感染48小時后，病毒基因組可擴增1000倍。因此，以SV40病毒基因組100bp長的SV40 ori 為基礎構建了表達載體，宿主細胞選用COS細胞。

COS細胞源于非洲綠猴細胞系（CV-1）。CV-1細胞經復制起始區缺陷的SV40病毒基因組轉化后，產生能表達SV40的大T抗原的COS細胞株。此細胞株除了能持續SV40的大T抗原外，還含有啟動帶有SV40 ori 的質粒進行復制所必須的所有細胞因子。這樣轉染到COS細胞的帶有SV40 ori 的質粒就可進行快速擴增。每個COS細胞將積累>105個帶有SV40 ori 的重組表達質粒，并高效表達外源DNA基因。由于轉染的質粒不受約束地復制，直到細胞不能忍受如此大量的DNA在它的染色體外進行復制，最終導致死亡，所以這一系統是瞬時表達系統。

在COS細胞中的表達載體,除了SV40 ori序列以外,還必須含有以下結構:原核DNA復制起始點(ori)及原核可選擇性標記,以便表達載體與質粒的構建及在細菌中增殖；真核細胞蛋白質表達元件：包括啟動子、增強子、轉錄后加工的信號序列（能有效得加上polyA）、內含子（帶有剪接供體和剪接受體的功能位點）以及轉錄終止信號序列。以保證真核基因的有效表達；設計一定的限制性內切酶的位點，以便外源目的基因的插入。

pMT2是一個帶有SV40ori的瞬時表達載體，見圖7-16，可以在COS 細胞中進行瞬時表達。

（2）COS細胞瞬時表達系統的應用： COS細胞瞬時表達系統是研究哺乳類細胞基因表達調控的簡便方法。某些原核或真核基因可作為測定哺乳類基因啟動子轉錄活性的基因，將要測定的真核基因表達的調控區克隆與這些基因前，通過研究在不同情況下這些基因的表達水平，來分析基因的表達調控機制。分離編碼蛋白質的cDNA是COS細胞瞬時表達系統最有用的作用。從以哺乳類細胞表達載體為基礎而制備的cDNA文庫中分離分泌蛋白質的編碼cDNA，可按以下步驟進行：

帶SV40 ori的表達載體在COS細胞中轉染以后可得到高水平表達的蛋白質。回收、分析，可用做生物試劑，并可用作蛋白質結構與功能的研究。并可作為對組建的真核基因表達載體的快速評估系統