DNA重組（DNArecombination）技術：外源基因的蛋白表達2

2.包涵體的分離與純化

細胞破碎時提取細胞內產物的關鍵。對于細菌的裂解常用的有酶溶法、超聲破碎法、化學滲透法、玻璃珠研磨等。包涵體可通過超聲波、勻漿等常規的方法是菌體破碎后，離心就可得到。密度梯度離心后可得到高純度的包涵體。包涵體一般不溶于水，為了獲得可溶性的蛋白質可加入強蛋白質變性劑后使其溶解。一般有鹽酸胍（5～8mmol/L）、尿素(5～8mmol/L)等，也可用酸性溶液直接溶解包涵體，使非共價聚集的蛋白質分子間分離；若包涵體內蛋白質多肽鏈中含有半胱氨酸時，可采用低pH值加含巰基的試劑巰基乙醇或二硫蘇糖醇和適量的SDS，使蛋白質完全還原，呈溶解狀態。

3.包涵體的復性

包涵體中蛋白質必須恢復其生物活性，稱為包涵體蛋白質的復性，通過逐步降低變性劑濃度，可使表達蛋白恢復其天然構型。復性效率與蛋白質的純度和濃度、殘留變性劑的濃度、復性時溶液的pH值、離子強度、溫度等許多因素有關。常用的復性的方法有逐步稀釋法或透析。

大腸桿菌表達系統在實際應用中存在著一些不足之處，由于缺乏轉錄加工的機制，因此只適合表達克隆的cDNA, 不宜表達真核基因組DNA；由于缺乏適當的翻譯后加工機制，大腸桿菌表達系統表達的真核蛋白質不能形成一定的折疊、修飾，只適宜表達翻譯后不需進行加工的真核蛋白，或不進行翻譯后加工不影響生物學活性的真核蛋白；大腸桿菌表達系統表達的真核蛋白質往往形成不溶性的包涵體，需經過變性、復性處理，才能恢復生物學活性；利用大腸桿菌的分泌信號，可將外源蛋白分泌到細胞間隙或細菌培養液中，但很難大量表達分泌性蛋白，產量不高；表達的真核蛋白在原核細胞中不穩定，容易被細菌蛋白酶破壞。

二、真核表達體系

與原核表達體系相比，真核表達體系如酵母、昆蟲及哺乳類動物細胞表達體系顯示了較大的優越性。

（一）酵母表達體系

酵母表達系統中最常用的啤酒酵母，酵母是單細胞真核生物，具有真核細胞的特點，可以對蛋白進行多種翻譯后修飾，如蛋白的糖基化；能進行所設計的翻譯后修飾，例如正確的二硫鍵的形成和信號肽的蛋白質水解；酵母的培養簡單，無需特殊的培養基，培養基中沒有蛋白質的加入；酵母自身的分泌蛋白很少，能把外源基因產生的蛋白質分泌到培養基中，便于分離純化，是一個理想的分泌型表達系統；啤酒酵母具有較高的安全性，沒有內毒素，無致病性。現在已分離得到幾個較強的酵母基因啟動子，可以調控基因進行高效表達；總之，酵母表達系統具有一個產量高，分泌型的特點，先后成功表達了多種干擾素、人表皮生長因子、人乙型肝炎表面抗原和核心抗原等。

1.酵母表達載體

是在酵母克隆載體的基礎上帶上一定的表達結構而成的。一般情況下表達載體均是質粒型,并且是穿梭載體,即它們都含有在酵母細胞和大腸桿菌細胞中發揮作用的可選擇遺傳標志和復制子。這些穿梭載體再插入一些表達結構包括酵母啟動子和一個或多個供外源蛋白質編碼序列插入的限制性酶切位點，轉錄的起始序列、轉錄終止序列和編碼有用的蛋白質結構域的序列。

(1)選擇性標志: 選擇性標志通常選用的是野生型基因，如URA3、LEU2、HIS3和TRP1。這些基因可以補償酵母細胞某一特定的代謝缺陷（營養缺陷）。這些標志和細菌質粒中的抗生素標記不同，它們必須與具有可被互補的適當突變宿主菌株結合。這些選擇性標志基因往往插入大腸桿菌質粒載體中構成整合型質粒。

(2)復制子: 大多數酵母表達載體源于2μm環的克隆載體。2μm環是一種在釀酒酵母中天然存在的一種內源性質粒DNA，是1967年美國芝加哥大學的Sinelari發現的，長度為2μm。2μm質粒一般存在與細胞核中，在每個細胞中平均拷貝數是50-100，能穩定存活于細胞中，它的復制和染色體的復制通常是同步的，都發生S期。帶2μm環的克隆載體是在整合型質粒插入2μm質粒的復制起始點構成的。

(3)常用的啟動子: 外源基因在酵母細胞中表達，在酵母克隆載體的基礎上，一定要帶有酵母基因的啟動子，常用的酵母基因啟動子有：醇脫氫酶，磷酸甘油酸激酶，3-磷酸甘油醛脫氫酶，蔗糖酶，酸性磷酸酯酶和酵母交配因子（MFα）。

(4)上游活性序列: 酵母各類基因中，它的上游普遍存在著一段活性序列，它的作用類似于哺乳動物細胞基因的增強子。上游活性序列位于轉錄起始點上游幾百個堿基處，它的激活能促進轉錄。

(5)終止序列: 在酵母表達載體在啟動子和克隆位點均含有翻譯的終止學列，它可引起RNA聚合酶II終止轉錄。另外更重要的是，啟動子下游轉錄終止序列的出現可增加mRNA的數量和蛋白質表達的總量。

(6)有用的蛋白結構域: 許多表達載體在啟動子的下游帶有編碼有用蛋白質結構域的DNA序列。這些結構域有：信號肽序列，可引導表達產物分泌到細胞外培養基中；核定位序列，可引導表達產物運送到細胞核中。

2.酵母表達外源性基因的形式

酵母表達外源性基因的形式有直接表達和分泌性表達二種。直接表達外源性蛋白是指外源蛋白質表達后積累于酵母細胞質中不分泌出來。比較成功的例子是人乙型肝炎表面抗原在酵母細胞內的表達。分泌性表達是指蛋白質在酵母細胞中表達后，為了便于糖基化以及純化的方便，往往利用一些酵母分泌型表達載體最終能產生信號肽，將外源蛋白質分泌于細胞外或培養基中，實現外源表達基因的分泌。這些分泌型表達載體帶有的分泌信號序列通常是帶有α因子前導序列的，它以酵母細胞為受體細胞，組成酵母外源性蛋白分泌表達系統。α因子是由13個氨基酸殘基組成的多肽。它首先一前體的形式表達，這個前體由165個氨基酸組成，包括89個氨基酸組成的信號肽，信號肽的分泌、表達可以介導外源性蛋白的分泌表達。因此，將編碼α因子信號肽的DNA片段插入在一個適合的酵母啟動子的下游，構建酵母細胞分泌表達系統。

（二）哺乳動物細胞表達體系

哺乳動物細胞表達系統是指采用某種方式將外源基因導入細胞，在哺乳動物細胞中表達獲得一定的有用的蛋白質，這一類真核基因的表達系統稱為哺乳動物細胞表達系統。哺乳動物細胞不僅可以表達克隆的cDNA，而且還可以表達真核基因組的DNA；哺乳動物細胞表達的蛋白通常可以被適當的修飾，而且表達的蛋白質回恰當地分布在細胞的一定區域并積累。哺乳動物細胞表達系統的最大缺點是操作技術難、費時、不經濟。

1. 常用的哺乳動物細胞表達載體

有SV40病毒表達載體、痘病毒表達載體、逆轉錄病毒表達載體，常見的哺乳動物表達載體的組成成分有：原核DNA序列、啟動子、增強子、拼接信號、終止信號和多聚腺苷酸化信號、篩選標記及真核病毒序列等。
(1)原核DNA序列： 為了能在大腸桿菌中增殖，得到大量能轉染哺乳動物細胞的重組DNA，不哺乳動物表達載體中通常有一段原核序列，包括一個能在大腸桿菌中自身復制的復制子，便于挑選含重組DNA細菌的抗生素抗性基因，以及便于把真核序列插入載體的少數單一限制性酶切位點。當具備這些序列以后，外源的真核基因序列可由單一酶切位點插入載體中，形成的重組DNA可在大腸桿菌中增殖，經抗生素篩選后進行DNA提取，即可得到大量的所需的哺乳動物細胞表達載體。

(2)啟動子： 真核生物的啟動子區域位于TATA區上游100bpd到230bp之間，TAT區位于轉錄起始點上游25-30bp處。啟動子的轉錄銷路因細胞而異。因此需根據宿主細胞類型選擇不同的啟動子。

(3)增強子： 增強子是使啟動子的基因轉錄效率顯著提高的一類順式作用元件，有多個獨立核苷酸序列組成。它們的作用通常不具有方向性，在位于轉錄起始點的下游或離啟動子很遠是仍有活性。許多增強子只能在特定的組織或細胞中起作用，即具有組織細胞的特異性，因此在構建真核表達載體的時候，應根據宿主細胞來選擇增強子。

(4)剪接信號： 真核基因由許多內含子和外顯子組成。被轉錄成mRNA前體以后，需通過剪除內含子、連接外顯子才能成為成熟的mRNA。一般mRNA拼接需要的基本序列位于內含子的5’和3’末端，因此，改變拼接位點5’和3’末端兩側的外顯子序列可能回影響鄰近拼接位點的使用效率，在替換外顯子是應注意。

(5)終止信號和多聚腺苷化的信號： 轉錄的終止信號常常位于多聚腺苷化位點下游的一端長度為幾百個核苷酸堿基的DNA區域內。多聚腺苷化需要兩種序列：位于腺苷化位點下游的GU豐富區或U豐富區和位于腺苷化位點上游11-30個核苷酸處的一個有6個核苷酸堿基組成并高度保守的AAUAAA序列。為了保證目的mRNA能有效地多聚腺苷化，真核表達載體上必須包括多聚腺苷化下游的一端序列。最常用的方法是用SV40的一端237bp長的BamHⅠ- BclI 限制性片段，含有多聚腺苷化的信號。另一種的方法是將全長 cDNA與已組裝在表達載體上一個順式作用因子的部分片段融合，提供多聚腺苷化的信號。