一、 限制性核酸內切酶及其應用
（一）限制性核酸內切酶的發現
當λ(k)噬菌體侵染E.coliB時，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識別的堿基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉移給限制酶識別序列的特定堿基，使之甲基化。
Eco核酸酶不能識別已甲基化的序列。B
最早分離出的限制內切酶是在1968年，Meselson和Yuan，大腸桿菌B和K菌株，EcoB和EcoK， 是I型的，沒有實用價值。
首個II型限制內切酶是在1970年，由H.O.Smith等從Heamophilus influenzae的Rd菌株中Hind II 。使得DNA分子的體外精確切割成為可能。
從此，相關研究展開。如NEB公司的提取和克隆。目前已純化出3000種限制性內切酶中，其中有30%是在NEB發現的 。
限制性核酸內切酶（restriction endonuclease ）：是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結構的核酸內切酶。切開的是3，5－磷酸二酯鍵。
（二）限制性核酸內切酶的分類
分為I型、II型和III型。
（三）限制性核酸內切酶的命名
1、寄主菌屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成3個斜體
字母的略語表示酶來源的菌種名稱，如大腸桿菌Escherichia coli 表示為Eco , 流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示為Hin；
2、用一個正體字母表示菌株的類型，比如EcoR、Hind；
3、如果一種特殊的寄主菌株具有幾個不同的限制修飾體系，則用羅馬數字標出，比如Eco R I、 Hin。d III
（四） II型限制性核酸內切酶的基本特性
1、識別位點的特異性
每種酶都有其特定的DNA識別位點，通常是由4～8個核苷酸組成的特定序列（靶序列）。
2、識別序列的對稱性
靶序列通常具有雙重旋轉對稱的結構，即雙鏈的核苷酸順序呈回文結構。
3、切割位點的規范性
交錯切或對稱切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。
與II型核酸內切酶有關的幾個概念
粘性末端：cohesive ends是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互補堿基的單鏈延伸末端結構，它們能夠通過互補堿基間的配對而重新環化起來。
平 末 端 ：Blunt end在識別序列對稱處同時切開DNA分子兩條鏈，產生的平齊末端結構。則不易于重新環化。
同裂酶：isoschizomers 能識別和切割同樣的核苷酸靶序列的不同來源的內切酶。不同同裂酶對位點的甲基化敏感性有差別。
同尾酶：isocaudamers 識別的靶序列不同，但能產生相同粘性末端的一類限制性核酸內切酶。如BamH I 、BclI、BglII和Xho I 是一組同尾酶。
注意： 由同尾酶產生的粘性末端序列很容易重新連接，但是兩種同尾酶消化產生的粘性末端重新連接形成的新片段將不能被該兩種酶的任一種所識別。
（五）限制性核酸內切酶的消化反應
一個限制酶單位（U）指：在理想的反應條件（適宜的緩沖液和反應溫度，通常為37℃）下，1h內中完全降解1 mg l DNA所需要的酶量。
影響酶活性的因素很多，最重要的有：
⑴ DNA的純度
⑵ DNA的甲基化程度
⑶ 酶切反應的溫度（通常為37℃ ）
⑷ DNA的分子結構
⑸ 核酸內切限制酶的緩沖液
在“非最適的”反應條件下,有些核酸內切限制酶識別序列的特異性便會發生“松動”，從其“正確”識別序列以外的其它位點切割DNA分子，這種現象叫星號活性。用*表示。
二、 DNA連接酶及其應用
（一）DNA連接酶的發現
環形DNA分子的發現使科學家相信一定有一種能連接這種切口的酶存在。
首個DNA連接酶(ligase)——大腸桿菌DNA連接酶，是1967年發現的，是大腸桿菌基因編碼。
1970年，發現了T4DNA連接酶，由大腸桿菌T4噬菌體基因編碼的。
（二） DNA連接酶作用特點
1. 連接的兩條鏈必須分別具有自由3’－OH和5’－P，而且這兩個基團彼此相鄰；
2. 在羥基和磷酸基團間形成磷酸二酯鍵是一種耗能過程。
E.coli DNA連接酶 －連接具互補堿基黏性末端(最初研究表明），現在研究可連接平末端；需NAD+輔助因子，活性低，不常用。
T 4DNA連接酶－連接具互補堿基黏性末端和平末端，需ATP輔助因子，活性高，常用。