真核細胞表達系統1

自上世紀70年代基因工程技術誕生以來，基因表達技術已滲透到生命科學研究的各個領域。并隨著人類基因組計劃實施的進行，在技術方法上得到了很大發展，時至今日已取得令人矚目的成就 。隨著人類基因組計劃的完成，越來越多的基因被發現，其中多數基因功能不明。利用表達系統在哺乳動物細胞內表達目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。

在各種表達系統中，最早被采用進行研究的是原核表達系統，這也是目前掌握最為成熟的表達系統。該項技術的主要方法是將已克隆入目的基因DNA片段的載體(一般為質粒)轉化細菌(通常選用的是大腸桿菌)，通過IPTG誘導并最終純化獲得所需的目的蛋白。其優點在于能夠在較短時間內獲得基因表達產物，而且所需的成本相對比較低廉。但與此同時原核表達系統還存在許多難以克服的缺點：如通常使用的表達系統無法對表達時間及表達水平進行調控，有些基因的持續表達可能會對宿主細胞產生毒害作用，過量表達可能導致非生理反應，目的蛋白常以包涵體形式表達，導致產物純化困難；而且原核表達系統翻譯后加工修飾體系不完善，表達產物的生物活性較低。

為克服上述不足，許多學者將原核基因調控系統引入真核基因調控領域，其優點是：

①根據原核生物蛋白與靶DNA間作用的高度特異性設計，而靶DNA與真核基因調控序列基本無同源性，故不存在基因的非特異性激活或抑制；

②能誘導基因高效表達，可達105倍，為其他系統所不及；

③能嚴格調控基因表達，即不僅可控制基因表達的“開關”，還可人為地調控基因表達量。

因此，利用真核表達系統來表達目的蛋白越來越受到重視。目前，基因工程研究中常用的真核表達系統有酵母表達系統、昆蟲細胞表達系統和哺乳動物細胞表達系統。

1、酵母表達系統

最早應用于基因工程的酵母是釀酒酵母，后來人們又相繼開發了裂殖酵母、克魯維酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表達系統是目前應用最廣泛的酵母表達系統。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Candida Bodini，Pichia Pastris3種。以Pichia Pastoris應用最多。

甲醇酵母的表達載體為整合型質粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中。大部分甲醇酵母的表達載體中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一1(A0x1)，在該基因的啟動子(PAXOI)作用下，外源基因得以表達。PAXOI是一個強啟動子，在以葡萄糖或甘油為碳源時。甲醇酵母中AOx1基因的表達受到抑制，而在以甲醇為唯一碳源時PAXOI可被誘導激活，因而外源基因可在其控制下表達,將目的基因多拷貝整合入酵母染色體后可以提高外源蛋白的表達水平及產量。此外甲醇酵母的表達載體都為E.coli／Pichia Pastoris的穿梭載體，其中含有E.coli復制起點和篩選標志，可在獲得克隆后采用E.coli細胞大量擴增.目前，將質粒載體轉入酵母菌的方法主要有原生質體轉化法、電擊法及氯化鋰法等。甲醇酵母一般先在含甘油的培養基中生長。培養至高濃度。再以甲醇為碳源。誘導表達外源蛋白。這樣可以大大提高表達產量。利用甲醇酵母表達外源性蛋白質其產量往往可達克級。與釀酒酵母相比其翻譯后的加工更接近哺乳動物細胞，不會發生超糖基化。

利用PAXOI表達外源蛋白時,一般需很長時間才能達到峰值水平，而甲醇是高毒性、高危險性化工產品。使得實驗操作過程中存在不小的危害性。且不宜于食品等蛋白生產。因此那些不需要甲醇誘導的啟動子受到青睞包括GAP、FLD1、PEX8、YPTI等多種。利用三磷酸甘油醛脫氫酶(GAP)啟動子代替PAXOI，不需要甲醇誘導。培養過程中無需更換碳源，操作更為簡便，可縮短外源蛋白到達峰值水平的時間。

酵母表達系統作為一種后起的外源蛋白表達系統，由于兼具原核以及真核表達系統的優點，正在基因工程領域中得到日益廣泛的應用。

2、昆蟲細胞表達系統

桿狀病毒表達系統是目前應用最廣的昆蟲細胞表達系統，該系統通常采用目宿銀紋夜蛾桿狀病毒(AcNPV)作為表達載體。在AcNPV感染昆蟲細胞的后期，核多角體基因可編碼產生多角體蛋白，該蛋白包裹病毒顆粒可形成包涵體。核多角體基因啟動子具有極強的啟動蛋白表達能力，故常被用來構建桿狀病毒傳遞質粒。克隆入外源基因的傳遞質粒與野生型 AcNPV共轉染昆蟲細胞后可發生同源重組，重組后多角體基因被破壞，因而在感染細胞中不能形成包涵體，利用這一特點可挑選 出含重組桿狀病毒的昆蟲細胞但效率比較低，且載體構建時間長，一般需要4~6周。此外，昆蟲細胞不能表達帶有完整N聯聚糖的真核糖蛋白。