紅細胞粘附功能測定

（一）花環法測定紅細胞CD35分子

紅細胞膜上Ｃ3b受體（CD35）可與補體致敏的酵母菌粘附形成花環（RBC－Ｃ3bＲ花環）；紅細胞膜上粘附的ＩＣ中Ｃ3b分子可與未致敏的酵母菌粘附形成花環（ＲＢＣ－ＩＣ花環）。RBC－Ｃ3bＲ和RBC－IC花環率可作為紅細胞免疫粘附功能的指標，如二項指標都低下，判為原發性紅細胞免疫功能低下，為紅細胞膜Ｃ3b受體受到破壞和影響所致；如果RBC－Ｃ3bＲ花環率降低，而RBC－IC花環率增高，為繼發性紅細胞免疫功能低下，是由于CIC增加，紅細胞粘附IC過多引起的。此兩項試驗可作為臨床上免疫性疾病的療效及預后檢測指標，亦可作為器官移植、疾病發病機理與藥物篩選的紅細胞免疫指標，以及用于中醫中藥作用的免疫學研究。

【材料】

１動物：昆明種小白鼠。

２試劑：肝素，生理鹽水，酵母菌，0.25%戊二醛。

３器材：離心機，細胞計數板，二層定性濾紙，光學顯微鏡，試管，水浴箱，玻片。

【方法】

１制備待測紅細胞懸液：將肝素抗凝的血用生理鹽水洗滌離心3次，2000ｒ/min離心3～5min，計數后配成1×108/mL紅細胞懸液備用。

２酵母菌培養：取酵母菌菌種接種于沙保培養基，28℃培養24ｈ即可。

３制備補體致敏的酵母菌懸液：將酵母菌用生理鹽水洗滌3次后，配成１%懸液，水浴內煮沸20min，充分混勻。用二層定性濾紙（或16層紗布）過濾，除去小凝塊，在低倍鏡下呈單個酵母菌細胞分散狀態，加等量小白鼠血清，混勻后置37℃水浴致敏15min。用生理鹽水洗滌１次，2500ｒ/min離心10min。去盡上清，用生理鹽水重混懸。計數后配成1×10８/mL補體（C3）致敏的酵母菌懸液。

４取兩支小試管，每管加待測紅細胞懸液100uL，第一管再加補體致敏酵母菌懸液

100uL，第二管加未致敏的酵母菌懸液100uL，搖勻放37℃水浴30min；取出用手腕輕輕搖勻，加生理鹽水200uL；混勻后，再加0.25%戊二醛75uL輕輕混勻；分別取1/3量水平涂片，吹干，加甲醇固定；用瑞氏法染色，油鏡下計數。

５紅細胞上粘附2個或2個以上酵母菌者為花環。分別計數200個紅細胞，算出花環陽性細胞百分率。第一管為RBC－C3b受體花環率，第二管為RBC－IC花環率。

【注意事項】

１酵母菌要分散不能自凝，要充分吹打分散。

２水浴時防止紅細胞破壞。

３細胞計數要準確，紅細胞與酵母菌比例要合適。

（二）紅細胞對腫瘤細胞免疫粘附能力的測定

腫瘤細胞可通過旁路途徑激活并粘附補體，與紅細胞C3b受體結合，紅細胞還可識別腫瘤抗原與腫瘤細胞粘附，攻擊癌細胞，形成花環狀。這為研究腫瘤病人紅細胞與血清中補體樣物質共同殲滅腫瘤細胞能力的變化規律及機理提供了有力的手段。

【材料】

１動物：昆明種小白鼠。

１試劑：0.25%戊二醛，生理鹽水，腫瘤細胞。

２器材：試管，玻片，吸管，離心機，水浴箱，100uL加樣器。

【方法】

１靶細胞準備：靶細胞為腫瘤細胞，經生理鹽水洗滌一次，1000ｒ/min離心１０min后，配成1×10６/mL懸液。

２制備新鮮血清和待測紅細胞懸液：小鼠眼球取血，其中一只取出的血置于加了肝素的試管中，然后水平離心2000ｒ/10min后，取上清即為小鼠新鮮血清；另一只取出的血直接置于試管中，用生理鹽水洗滌3次（每次水平離心2000ｒ/5min），制備成1×10８/mL待測紅細胞懸液。

3測紅細胞免疫粘附活性，采用“直向腫瘤紅細胞花環實驗”：取小鼠新鮮血清100uL加腫瘤細胞懸液100uL混勻，放37℃水浴30min；用生理鹽水洗滌一次，水平離心２０００ｒ/5min后，加待測紅細胞懸液50uL混勻，放37℃水浴30min；取出加100uL生理鹽水混勻后，再加0.25%戊二醛50uL混勻，水平涂片，瑞氏染色。腫瘤細胞呈藍色，紅細胞呈紅色，腫瘤細胞粘附上3個或3個以上紅細胞者為花環，計數100個癌細胞，算出花環率。

【注意事項】

１計數細胞時要準確，紅細胞與腫瘤細胞比例要合適。

２水浴時避免水致紅細胞破壞。

３戊二醛加入前后都應輕輕混合，避免假花環出現。