單克隆抗體技術

實驗概要

顯微鏡下觀察血片或骨髓片，找出異常細胞。

實驗原理

B淋巴細胞能夠產生抗體，但在體外不能進行無限分裂；而骨髓瘤細胞可以在體外無限傳代，但不能產生抗體。將這兩種細胞融合后，用一特殊選擇培養基(HAT)阻斷正常細胞或自體融合細胞的DNA合成通路，而雜交瘤細胞可利用補救通路合成DNA得以生存，且既能產生抗體，又能無限增殖，并以此生產抗體的技術。單抗技術是主要由抗原制備，免疫動物，細胞融合，篩選雜交瘤細胞，克隆化培養，單克隆抗體的大量制備與鑒定等一系列實驗組成的實驗系統，其核心部分是細胞融合。

細胞融合是單克隆抗體技術的中心環節，基本步驟是將脾細胞和骨髓瘤細胞混合后加入PEG使細胞彼此融合。

主要試劑

50%PEG，不完全培養液，HAT培養液，75%酒精。

主要設備

剪刀，鑷子，紗布，離心管，網篩，大小瓶皿，直頭滴管，彎頭滴管，瓶塞，培養瓶蓋，離心管蓋，燒杯(加入37℃水)，泡沫板，大頭針，96孔培養板，計時器，顯微鏡，計數板等。

實驗材料

Balb/c小鼠，SP2/0骨髓瘤細胞。

實驗步驟

1. 飼養細胞的制備

   1) 常用Balb/c小鼠，拉頸處死，浸泡于75%酒精內，3～5min。

   2) 用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜，剪一小口，用滴管注入5～6ml不完全培養液(嚴禁刺破腸管)。

   3) 反復沖洗，將沖洗液吸入15ml離心管，1000rpm5min離心，用完全培養液混懸，調整細胞密度。

2. SP2/0骨髓瘤細胞的制備

   1) 選取狀態良好、處于對數生長期的SP2/0骨髓瘤細胞。

   2) 棄去原瓶中培養上清，用不完全培養液沖洗三遍。

   3) 再以不完全培養液對細胞進行充分吹打，得到的細胞懸液移入15ml離心管。

   4) 細胞計數。

3. 脾細胞的制備

   1) 3天前加強免疫的小鼠，摘眼球取血后，拉頸處死，75％酒精浸泡3～5min。

   2) 將小鼠固定于泡沫板上，打開腹腔，取出脾臟，用不完全培養液反復沖洗。

   3) 在平皿中的網篩中，用鑷子夾取脾臟進行反復研磨，邊磨邊滴加不完全培養液，直到脾細胞單個化，將細胞懸液轉入15ml離心管中。

   4) 細胞計數。根據兩種細胞計數結果，調整懸液用量，配平之后(SP2/0細胞與脾細胞數量比值在1：5～1：10之間)，以1000rpm5min離心。

   5) 棄上清，每管加入5ml不完全培養液，吹打混勻后合并于同一15ml離心管中，再次以1000rpm5min。

   6) 離心，棄上清，用滴管吸凈殘留液體。

4. 細胞融合

   1) 前面步驟所得到的細胞沉淀，輕彈離心管管底，使其呈糊狀。

   2) 在37℃水浴中，輕輕振蕩，一邊緩緩加入1mlPEG，邊加邊搖，PEG于1min內加完。

   3) 加完PEG之后，將懸液在37℃水浴中靜置1min。

   4) 繼續在37℃水浴中，邊搖邊加入不完全培養液2ml，于2min內加完。

   5) 慢慢加入不完全培養液，800rpm，8min。

   6) 棄上清，加入含1％HAT、20％FCS的培養液，輕輕混勻。

5. 在96孔細胞培養板中加入飼養細胞上清，1滴/孔；之后加入融合細胞懸液，1滴/孔。

6. 鏡下觀察96孔板中細胞情況，CO₂孵箱中培養。

7. 實驗結果計算

一只小鼠可獲得(1～2.5)×10⁸個脾細胞，與(2～3)×10⁷個SP2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合。顯微鏡下可見單個分散的細胞，細胞培養3～5天后即可出現小克隆，雜交瘤細胞較大，呈圓形且透明，其它細胞透光性差并逐漸死亡。

注意事項

1. 細胞比例：骨髓瘤細胞與脾細胞的比值可從1:5到1:10不等。應保證兩種細胞在融合前都具有較高活性。

2. 培養液的成分：對融合細胞，良好的培養液尤其重要，其中的小牛血清、胎牛清、各種離子和營養成分均需嚴格配制。如融合效率降低，應隨時核查培養基情況。

3. PEG對細胞有毒性作用，所以滴加速度及時間至關重要，時間短影響融合，時間長會造成細胞毒性，日后細胞生長不好。

4. 新融合細胞較脆弱，所有操作過程需輕柔，避免過高速度離心或用力攪拌等。

5. 融合試驗最大的失敗原因是污染，融合成功的關鍵是提供一個干凈的環境，以及適宜的無菌操作技術。