太赫茲（THz）光譜在生物大分子研究中的應用（一）

 汪一帆^1） 尉萬聰^2） 周鳳娟^1）** 薛照輝^1）**

(¹⁾天津大學農業與生物工程學院,天津,300072;
 ²⁾清華大學生物科學與技術系，北京，100084)
 

    摘要 太赫茲（THz）輻射是一種新型的遠紅外相干輻射源，近年來在生物大分子研究中得到了廣泛的應用，特別是在生物分子的結構和動力學特性等方面有著巨大的應用潛力. 本文結合THz 光譜的特點，介紹了利用THz 光譜對蛋白質、糖類及DNA等生物大分子的探索研究，以及應用THz 技術測定水環境與生物分子的相互作用. 探討了該技術在生物領域應用中有待解決的問題及發展前景.

    關鍵詞 太赫茲, 生物, 蛋白質, 糖類, DNA

    學科分類號 O561, Q691

    在碳水化合物、蛋白質、核酸等生物分子的研究分析中，光譜學發揮著非常重要的作用. 太赫茲 (THz)輻射是指頻率在0.1~10THz (波長在30μm~3mm) 之間的電磁波，其波段位于微波和紅外光之間. 由于長期缺少有效的產生和探測技術，THz 波段曾一度被稱作“THz 空隙”. 近十幾年來超快激光技術和半導體材料科學與技術的迅速發展為THz 脈沖的產生提供了穩定、可靠的激發光源，促進了THz 輻射在光譜學和成像技術方面的應用.

    相比于紫外可見吸收光譜、傅里葉變換紅外光譜、圓二色譜、X 射線成像分析等傳統技術，THz 光譜有其獨特的優勢：（1）光譜的特征吸收：許多分子之間弱的相互作用（氫鍵、范德華力等）、生物大分子的骨架振動、偶極子的旋轉和振動躍遷以及晶體中晶格的低頻振動吸收正好處于THz 頻帶范圍，并且THz光譜技術對探測物質結構存在的微小差異和變化非常靈敏，具有反映化合物結構的指紋特征，因此THz 光譜技術在分析和研究生物大分子方面有著廣闊的前景^[1].（2）低能性：THz 電磁輻射的光子能量低，只有毫電子伏特，不會因為電離而破壞生物分子，因而是一種安全有效的無損檢測方法^[2].（3）高靈敏度：THz脈沖的典型脈寬在皮秒量級，不但可以對生物樣品進行時間分辨研究，而且可以有效地抑制遠紅外背景輻射噪音的干擾，輻射強度測量的信噪比和探測靈敏度遠高于傅里葉變換紅外光譜.（4）寬帶性：THz 脈沖源通常只包含若干個周期的電磁振蕩，單個脈沖的頻帶可以覆蓋GHz至幾十THz的范圍，便于在大的范圍里分析物質的光譜性質.（5）相干性：THz時域光譜技術 (THz-TDS) 的相干測量技術能夠直接測量THz電場的振幅和相，可以方便地提取樣品的折射率、吸收系數. 此外，THz 對生物分子中的水非常敏感，因此可以用于分析生物分子與水的相互作用.

    THz 光譜在生物分子的結構和動力學特性等方面有著重要的應用價值. 利用THz 技術可以獲得這些生物分子在THz 波段的光學常數,進而可以研究它們的光譜特征. 國內外研究者已經利用THz 光譜對DNA、蛋白質和糖類等生物分子的探索研究. 本文主要綜述了近年來THz光譜在生物領域中的應用及進展.

1 THz 光譜在蛋白質研究中的應用

    蛋白質是細胞內含量最高的組分，酶、抗體、多肽激素、輸送媒介等都是由蛋白質構成的. 蛋白質是在結構與功能上種類最多的一類分子，它們在生命體系中起著關鍵作用. 蛋白質的基本分子單位是氨基酸，其結構通式為R–C_α( H) (N H3⁺)–COO^–，R代表可變的側鏈，該側鏈對蛋白質體系的介電和電子學特征起著重要作用. 氨基酸的結構為一大的偶極子，對它進行振動光譜的研究有利于深入了解蛋白質的微觀結構和功能.

    氨基酸在THz波段的吸收是由分子轉動或扭動造成的，氨基酸的不同結構造成了它們在THz波段不同的吸收峰位. Kikuchi^[3]首次利用變角THZ-TDS測定L-半胱氨酸和L-組氨酸的氨基酸單晶體. 王雪美等^[4]利用THz-TDS技術研究室溫條件下多晶含硫氨基酸L-蛋氨酸和L-半胱氨酸的光譜特性，發現含硫氨基酸吸收峰的非諧性以及較寬的吸收譜帶和平臺可能是源于分子間相互作用的聲子吸收.

    多肽是肽鍵連接氨基酸構成的多聚體. 由于多肽肽鏈內或鏈間存在荷電基團，因此也就存在著靜電作用的力（通稱鹽鍵，如–NH₃⁺_…-OOC–）,這種力也可能在荷電基團與偶極基團、或偶極基團與偶極基團之間發生，鏈內的靜電作用比鏈間的強. 對于多肽鏈分子還存在范德華力（如–CH₂OH_…HOCH₂–），在鏈內的基團間或分子鏈間都可能有范德華的吸引或排斥力，特別是一些龐大基團的色散偶極和誘導偶極間會呈現出主要的范德華作用力. 而THz-TDS 對氫鍵、范德華力等許多分子之間弱的相互作用非常敏感，具有反映化合物結構和環境的指紋特征，因此可以用來鑒定肽的結構.

    肽的光譜特征與其氨基酸組成、排列順序、分子間氫鍵以及晶體結構密切相關. Plusquellic^[5]利用THz-FTIR技術檢測不同晶型的多肽，結果獲得了明顯不同的THz波譜，并且發現短鏈晶型的多肽在50~500cm^-1 THz波段有明顯的特征吸收.

    蛋白質的一級結構表示多肽鏈特有的氨基酸排列序列. 二級結構描述多肽鏈被氫鍵所穩定的部分，如α-螺旋、β-折疊和β-轉角. 三級結構定義為半胱氨酸殘基之間的二硫鍵，以及其它非共價力，如疏水鍵、氫鍵和靜電力所穩定的立體結構. 四級結構指兩個或者多個肽鏈的相互作用.

    很多蛋白質的集體振動模式在THz 范圍內，生物分子的集體運動模式對分子的構象、結構及分子環境變化非常敏感. Markelz 等^[6]首次利用THz-TDS研究了DNA、牛血清蛋白和膠原質在0. 06~2. 00THz 波段的性質，表明這些生物分子的大量低頻集體振動模式具有紅外活性，這一結果引起了人們對利用THz-TDS研究生物大分子的極大興趣. 這之后，他對集體振動模式的相對作用和馳豫作用進行了深入研究^[7]，發現在樣品一致并考慮多重反應的條件下，生物大分子在THz 波段的總介電響應譜帶范圍較寬且沒有特征吸收，但該響應卻對水合作用、溫度、綁定、構造改變高度敏感，對這些效果的產生進行了討論，發現這是由表面側鏈的馳豫損耗引起的. Balu等^[8]利用低頻THz 光譜研究了視紫質和菌視紫紅質這兩種光活性蛋白質系統，以探討螺旋跨膜蛋白集體低頻運動. 結構相似的這兩種蛋白質，其受THz 輻射激活產生的振動特性有著驚人的相似. 具體來說，低頻時其細胞質環區非常活躍，高頻時其細胞外的環區被振動激活. 該研究表明THz光譜在確定蛋白質構象變化的振動自由度上有重要意義.

    近年來，隨著THz-TDS技術的發展，蛋白質結構及其動力學得以進行深入的研究. Markelz^[9]首次在200K的蛋白質動態躍遷中檢測出THz 介電響應，并發現光譜的溫度相關性與熱激活側鏈運動一致，且這一運動甚至包含亞皮秒級的動力學信息. He等^[10]利用THz-TDS技術研究蛋白質的動態躍遷，通過研究天然狀態和變性的雞蛋清溶菌酶，發現蛋白質結構不是產生動態躍遷的必要因素. 研究表明伴隨著激活反應，光譜特性與溫度有關，并且沒有由弱到強躍遷的跡象. 在此基礎上，他還利用THz - TDS技術觀察到短鏈聚丙氨酸動態躍遷到丙氨酸五肽的現象^[11]，但沒有發現丙氨酸二肽或丙氨酸三肽的躍遷. 該研究表明，光譜的溫度相關性確實產生于溶劑側鏈的相互作用. Chen等^[12]利用THz-TDS觀測PsbO蛋白的可逆性構造變化. Havenith等^[13]發現蛋白質的THz光譜對突變敏感，并受蛋白質表面電荷和柔性的影響.

    蛋白質折疊是指蛋白質可憑借相互作用在細胞環境(特定的酸堿度、溫度等)下自我組裝的過程. 研究蛋白質折疊可以有效的解釋分子生物學中心法則. 近年來，THz-TDS 技術在這一領域也開始發揮出重要作用.Havenith等^[14]利用THz 吸收動力學（KITA）光譜來研究蛋白質折疊過程中的THz 電場衰減和相轉移. 通過與熒光法、圓二色譜、小角度X 射線散射的數據進行對比，發現KITA 可檢測到在折疊早期和二級結構形成時結合水-蛋白質相互作用的重排現象，從而證明蛋白質二級結構形成與溶劑動力學有關.

2 THz 光譜在糖類研究中的應用

    糖類是生物體維持生命活動所需能量的主要來源，是合成其他化合物的基本原料，同時也是生物體的主要結構成分，對于保持生物分子空間構象和形成一定的生物學功能具有重要的作用. 糖分子中存在大量的氫、氧原子基團，其自身或者和其他生物分子都能形成大量的氫鍵，因此是研究氫鍵的典型體系.

    THz-TDS 對糖類的結構非常靈敏，可以反映糖類結構與環境的指紋特性，而且對于低頻區糖分子的定量檢測也非常有效. Shin等^[15]利用THz-TDS研究了從海帶多糖中提取出的不同結構β-葡聚糖的光譜特性，得到了三鏈螺旋（TSHs）和單鏈螺旋（SSHs）這兩種結構在0.1~2.0THz 波段的THz-TDS 吸收譜圖，結果表明不同結構的β-葡聚糖吸收譜表現出明顯不同的光譜特征. 楊麗敏等^[16]將幾種糖衍生物的THz 光譜吸收峰與紅外光譜中的OH 伸縮振動峰做了對比，研究表明THz 光譜吸收峰所對應的是涉及到分子間氫鍵振動的直接關系，不是只對應于某一化學鍵，而紅外光譜中的νOH 伸縮振動可以近似地與氫鍵體系相對應，這說明了THz光譜是紅外光譜的有益補充.

    近幾年，研究者們開始利用THz 光譜研究多糖及其衍生物. Fischer 等^[17]利用THz-TDS技術比較了在溫度300K和10K 時纖維素和幾丁質特征吸收峰的變化，這種差別可能是源于兩種物質在聚合物骨架的差異，幾丁質比纖維素結合著更多的側鏈基團.

3 THz 光譜在DNA 研究中的應用

    DNA是儲存、復制和傳遞遺傳信息的主要物質基礎，其二級結構為雙螺旋結構. DNA三級結構是指DNA鏈進一步扭曲盤旋形成超螺旋結構. 根據螺旋的方向可分為正超螺旋和負超螺旋. 正超螺旋使雙螺旋結構更緊密，雙螺旋圈數增加，而負超螺旋可以減少雙螺旋的圈數. 幾乎所有天然DNA中都存在負超螺旋結構.

    DNA 分子對THz 輻射的響應主要來自于由其分子的構形和構象決定的集體振動模. Wittlin^[18]研究了Li-DNA 和Na-DNA在0.09~13.5THz 波段，溫度從5~300K 時的光譜特征，分別于1. 35和1. 23THz 測出包括低頻模式在內的五種振動模式. 研究發現伴隨著水合作用產生了紅移現象. 應用點陣動力學模型可以較成功的解釋振動模式及其與水合作用的相互關系. Globus 等^[19]利用THz 技術在10~24cm頻率范圍內測量稀溶液中的DNA - art. no. 609308.

    Fisher等^[20]應用THz-TDS 技術研究了組成核酸的四種堿基（鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶）在0.5~4.0THz 波段，溫度分別為10K 和300K 時的吸收系數和折射率性質，且與應用Gaussion98 軟件包所得到計算結果有著很合理的一致性. 這說明四個低頻振動是由于分子間的氫鍵面內、外的運動所造成的，伴隨著一個氫鍵體系的彎曲運動，另一個氫鍵體系發生了扭轉或伸展運動.

    Li等^[21]基于雙鏈DNA十倍體的三維結構，對特定構象的低頻聲子模式與計算機模擬的相關性進行研究.實驗采用了常規模式分析和納秒級分子動力學兩種模型分析方法，發現相比常規模式分析，分子動力學與實驗結果更為相關，并證實在短DNA雙鏈中存在著大量的活躍低頻聲子模式.

    THz 光譜能鑒別出不同DNA序列的吸收或反射率，Weng等^[22]在此基礎上采用經驗模型分解，對DNA序列的THz 光譜進行了定量分析.

    THz 還可以應用在如DNA、寡聚核苷酸雜交過程以及生物芯片讀出等的無標記生物探測中. DNA分子的折射率與其結合狀態密切相關，因此THz 能夠通過獲得物質的吸收系數和折射率進而對DNA 進行無標記探測. Brucherseifer 等^[23]對DNA 分子雜交狀態與其復折射率的關系進行了研究，發現單或多核核苷酸的綁定狀態可通過監視THz經DNA的透射來推知. Nagel 等^[24]利用THz-TDS作為DNA序列分析工具研究了DNA鏈雜交，實驗證明雜交過程中的THz 吸收光譜有很大的不同，這表明DNA的自由鏈和雜交鏈易被THz光譜所區別. 這種技術的高靈敏度甚至可以和熒光標記技術相媲美.