質譜成像新觀察：MALDIMS成像最新應用

　　基質輔助激光解吸電離技術（MALDI）的出現使得質譜成像技術（Mass spectrometry imaging，MSI）可以用于測定組織內生物大分子的位置和分布，以及疾病生物標志物的鑒定和改變等。近日布魯克成像全球應用開發經理Shannon Cornett博士討論了質譜成像技術的最新進展及其對臨床診斷研究的影響。

　　布魯克成像全球應用開發經理Shannon Cornett博士

　　什么是質譜成像？

　　質譜成像最初是在50多年前作為研究半導體表面分析工具所發明的。如今，結合質譜技術，質譜成像可以通過分子質量實現生物標志物、代謝物、肽或蛋白質等的分子空間分布可視化。實際上在樣品掃描過程中，質譜數據是在空間坐標陣列上收集的。通過在譜圖分析結果中選擇與感興趣化合物相對應的峰，結合質譜數據繪制該化合物在樣品中的分布圖，從而生成質譜空間分布圖。

　　1988年，Franz Hillenkamp和Michael Karas發現了一種用激光照射生物分子和小型有機酸結晶混合物的新方法，并稱之為基質輔助激光解吸電離（MALDI），為從有機、高分子化學到蛋白質組學、微生物學和藥物研發等科學研究開辟了新的可能。Richard Caprioli及其同事在20世紀90年代末進行了一項開創性工作——他們展示了MALDI-MS如何應用于細胞和組織中大生物分子（如蛋白質和脂類）的分布研究，從而揭示出癌癥等疾病是如何改變這些分子表達的。質譜成像有不同的電離技術，包括二次離子質譜（SIMS）、MALDI和解吸電噴霧電離（DESI）。目前MALDI是質譜成像臨床和生物學應用的領先技術，被廣泛認為是組織樣本成像最有效的方法。

　　質譜成像目前在臨床科研有哪些應用？

　　MALDI成像技術在臨床研究中不斷得到認可。近年來，技術和方法上的突破讓MALDI成像在分析通量、空間分辨率和靈敏度得到了顯著提高，這增加了MALDI成像在腫瘤學、神經疾病學、心臟病學和風濕病學等生物醫學研究領域的應用范圍。MALDI成像應用包含蛋白質表征、糖蛋白分析、質量控制應用、聚合物分析和超高通量篩選等。在臨床研究中，大約85%的MALDI成像與癌癥研究有關，其它15%的MALDI臨床研究應用包括帕金森氏癥、老年癡呆癥、糖尿病、非酒精性脂肪肝以及腫瘤邊緣檢測。

　　MALDI-MS成像的最新技術是什么？

　　質譜成像技術中每個像素包含的信息是這些特定細胞的未標記化學指紋（或質譜）信息，因此推動質成像發展的因素有兩點：一是更快地獲取像素，二是增加每個像素位置檢測到的分子數量。

　　最近，一種新的名為MALDI-2的技術組合在靈敏度上有了顯著的提高，該技術由MALDI成像與后電離（PI）相結合。研究表明， MALDI-2技術將許多小分子和脂質的靈敏度提高了三個數量級。此外，由于某些化合物只能用MALDI-2檢測，這進一步擴展了MALDI成像的適用范圍，對藥物代謝和藥代動力學（DMPK）的研究具有重要意義。

　　現代藥物開發的一個主要限制因素是“充分攪拌模型”的使用，也就是說在使用LC-MS方法進行分析和定量之前，把器官和組織勻漿。這種方法非常適合于獲得靶器官內精確數量的藥物和代謝物信息，但與試圖描述藥物化合物生理效應的病理學方法并不兼容。MALDI成像通過精確定位藥物和代謝物在組織中的位置，對從血漿到組織模型的轉換產生了重大影響。新型的PI源通過提高整體靈敏度，增強了藥物研究的分子成像能力，使其能夠在更大的劑量范圍內進行定量分析。此外，檢測分子種類的增加，擴展了質譜成像在藥物研究中外源性和內源性分子的適用性。

　　疾病診斷和預后的生物標志物鑒定是臨床研究的重要方面，近來的發展對此有什么幫助？

　　癌細胞和其他病變組織具有顯著的遺傳性和表觀遺傳性，影響基因組表達各個方面。無論觀察蛋白質組、脂質組還是代謝組，化合物的空間分布包含了有助于了解樣本的重要信息。如果某些化合物在空間上高度集中，或者分子共同分布在某些特定的位置，當只檢查均質樣品時，這些特征信息就會丟失。當與空間信息關聯起來時，基于組學研究的生物標記物發現將變得更加完整，從而為癌癥生長所需的細胞間通訊網絡提供重要線索。

　　結合前面提到的MALDI-2技術，成功的MALDI成像中的特定區域信息與4D組學深度覆蓋相結合，以用于生物標記物的發現和分子表征。其優點是分子信息量更大，可用于檢測組織切片中、具有共同分子特征感興趣的區域（ROIs）。例如，在一項對乳腺癌中腫瘤亞群的微蛋白質組學表征研究，分析了脂質的MALDI圖像，并用于識別和靶向激光捕獲顯微切割（LCM）特定分子表型的腫瘤亞群。研究人員對小型顯微解剖材料進行蛋白質提取和胰蛋白酶消化，隨后進行蛋白組學分析。通過蛋白質組學數據對每種分子表型的分析，為原位特征細胞類型的生物過程提供了更全面的機制解釋，補充了相關分析工作流程[1]。

　　MALDI and MALDI-2 detection of chloroquine in rat kidney (top images) and liver (bottom) tissue For further details see Henkel C et al. The combination of MALDI-2 and timsTOF flex brings targeted drug imaging to the next level. Bruker 2020； LCMS-173, 1878095 (https://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/Separations_MassSpectrometry/Literature/ApplicationNotes/1878095_LCMS-173_Combination_of_MALDI-2_and_drug_imaging_ebook.pdf)University of York)

　　成像中近同重離子識別是一個挑戰，有哪些新技術可以解決？

　　當應用于DMPK時，定量質譜成像（qMSI）一直是MALDI成像中一個具有挑戰性但必不可少的方面。諸如普遍存在的同重內源性化合物、組織基質的化學背景以及離子抑制等許多因素，影響了定量質譜成像的可靠性。但要將MALDI成像技術作為一種多方面且普遍適用的技術，定量結果必須準確且可靠。這在藥理學研究中尤為關鍵，因為藥物及其代謝物在組織中的分布與絕對定量一樣重要。藥物在疾病部位的濃度決定了劑量的有效性和副作用的影響，這反過來也說明了各種給藥方法的效率。藥理學研究是通過藥物的藥代動力學和藥效動力學測量來指導的，這類研究通常需要篩選大量的樣本。速度、靈敏度、空間分辨率和特異性通常決定定量質譜成像方法的效率。

　　MALDI-2源與timsTOF-fleX的結合可以通過離子遷移率來分離同重離子，進而顯著提高目標化合物在復雜分子環境中定量的靈敏度和特異性。在較低的質荷比（m/z）范圍內，來自基質離子和高電荷態分析物離子（如二聚體）的同重和近同重干擾會影響質譜線性動態范圍，使得MALDI圖譜變得復雜。結果表明，通過平行累積連續碎裂（PASEF）和對應的四極桿隔離，把離子富集和選擇性洗脫結合提高了靈敏度[2]。

　　傳統MALDI成像在類固醇分析上受到限制，類固醇的重要性是什么和如何解決？

　　類固醇是一類重要的生物化合物，利用MALDI成像技術研究類固醇的分布，越來越受到人們的關注。類固醇激素作為細胞膜重要的組成部分，它影響了細胞膜的流動性和細胞信號傳導。在植物、動物和真菌中，人們已經發現了數百種類固醇。由于類固醇的非極性結構，如果沒有使用特殊的組織內衍生化方法，傳統的MALDI成像無法很好地將其離子化。MALDI-2能很好解決這一問題。研究表明，根據分析物和其濃度，MALDI-2技術可使類固醇的檢測靈敏度提高2-3個數量級[3]。

　　怎么看待MALDI成像的未來？

　　事實證明，MALDI成像是一種功能強大的質譜工具，可以對切片樣本在沒有標記的情況下，繪制從小分子代謝物到大分子蛋白質分布圖。由于MALDI成像技術的非標記特點，以及通過分子量以及碰撞截面區分化合物的能力，該技術的應用領域將被擴展和更廣泛。

　　MALDI成像技術適用于靶向和非靶向研究。使用MALDI成像的非靶向研究貫穿于整個臨床研究，其目的是利用區域特異性來發現疾病的新生物標志物和治療方法。MALDI成像還提供靶向治療藥物及其代謝物分布的直接監測，革新了臨床前藥物開發流程。此外，該技術的非標記特點使得從相同的靶標數據集中挖掘非靶標藥效學數據成為可能。圍繞植物、高分子和微生物的MALDI成像新應用也正在興起。最終，MALDI成像將影響疾病的治療。隨著這項技術不斷發展，儀器設備不斷進步，越來越多的分析和檢測可以從MALDI成像中獲益。

　　參考文獻

　　1.Oetjen J, Hebeler R, Dewex F, et al. MALDI Guided SpatialOMx uncovers proteomic profiles in tumor subpopulations of breast cancer. Bruker Daltonics 2020；LCMS-166, 1874319 

　　2.Stopka SA, McMinn MH, Looi WD, et al. TIMS enabled quantification of small molecules in MALDI imaging. Bruker Daltonics 2020；LCMS-172, 1878094 

　　3.Caution! MALDI-2 detects analyte classes never seen before. Bruker Daltonics 2020； FN-012, 1878090