為了全面探索YTHDF1及其靶基因之間的直接相互作用，作者對過表YTHDF1的A2780細胞，進行了eCLIP-seq，并鑒定了2,343個目標轉錄物，這些轉錄物大多數是mRNA。將eCLIP seq的結果2,343個基因和上面三組數據交集確定的647個基因取交集，產生175個基因，將其確定為YTHDF1的直接結合靶基因。接下來，作者分析了175個基因上，m6A峰和YTHDF1結合mRNA上的eCLIP峰的分布。作者發現這些轉錄本中的大多數YTHDF1結合位點（包括EIF3C）都與m6A位點非常吻合。GO分析表明，結合YTHDF1的轉錄本與翻譯調控最密切相關。EIF3C是真核轉錄起始因子EIF3的亞基之一，其翻譯控制有助于腫瘤發生。此外，EIF3C與多種癌癥（包括肝細胞癌，結腸癌和乳腺癌）的惡性行為相關。CLIP-qPCR還顯示YTHDF1最顯著富集EIF3C mRNA。這些數據表明EIF3C是YTHDF1在卵巢癌細胞中的直接靶標。
圖4 YTHDF1靶基因鑒定m6A測序數據展示
5. YTHDF1調節卵巢癌細胞中EIF3C的表達和整體蛋白合成
為了確認YTHDF1調節卵巢癌細胞中EIF3C的表達，作者沉默YTHDF1后，探究了EIF3C的轉錄和翻譯水平。如預期的那樣，YTHDF1沉默可降低EIF3C的蛋白質豐度，而不會影響EIF3C的mRNA水平。接著，利用RIP-qPCR（云序提供此服務）證實了YTHDF1和EIF3C
mRNA之間的相互作用。然后，作者針對YTHDF1和EIF3C
mRNA的結合位點設計突變（YTHDF1-mut），RIP-qPCR發現YTHDF1突變體與EIF3C
mRNA之間的相互作用顯著降低。蛋白質印跡分析顯示，YTHDF1-wt可以增強EIF3C的表達。
由于EIF3C是蛋白質合成所必需的EIF3復合物的關鍵亞基，因此作者接下來探討了YTHDF1是否會影響卵巢癌細胞的整體蛋白合成。為了測試這一點，作者使用HPG摻入法分析新蛋白質的合成。與對照細胞相比，EIF3C敲低后摻入到合成蛋白中的HPG在下降。同樣，與對照細胞相比，YTHDF1沉默的細胞也顯示HPG信號下降，這表明YTHDF1可以影響整體蛋白質合成。總的來說，這些數據表明YTHDF1通過調節卵巢癌細胞中的EIF3C蛋白表達來影響整體蛋白合成。
圖5 YTHDF1以m6A依賴性方式調節EIF3C翻譯
6. 回補EIF3C可改善YTHDF1沉默對卵巢癌細胞的抑癌作用
作者檢測卵巢癌組織中EIF3C的蛋白表達，發現EIF3C在卵巢癌中的蛋白表達顯著升高。
EIF3C敲低后，細胞生長、集落形成能力、細胞遷移和侵襲均受到明顯抑制。這些結果表明，EIF3C促進了卵巢癌的腫瘤發生。接著，作者在沉默YTHDF1的A2780和SKOV3細胞中過表達EIF3C，YTHDF1沉默會抑制細胞生長、集落形成、細胞遷移和侵襲，而EIF3C的回補則可以逆轉這種抑制作用。這些結果表明，EIF3C是YTHDF1促進卵巢癌進展的關鍵下游靶標。最后，作者分析了卵巢癌組織中EIF3C蛋白表達與YTHDF1蛋白表達之間的相關性，發現YTHDF1的蛋白質豐度與EIF3C的表達呈正相關。以上結果顯示，YTHDF1表達增加可以調節EIF3C翻譯進而增強整體蛋白質合成，并促進卵巢癌細胞的腫瘤發生。
圖6 YTHDF1依賴EIF3C促進卵巢癌細胞的生長和遷移
總結：
M6A甲基化是哺乳動物mRNA中含量最豐富的RNA修飾，越來越多的證據表明m6A在人類腫瘤發生中起著關鍵作用。本文，作者利用RNA-seq、MeRIP-seq和RIP-seq等多種技術聯合分析，發現甲基化識別蛋白YTHDF1的直接靶點--蛋白質翻譯起始因子eIF3的一個亞基EIF3C。YTHDF1通過與m6A修飾的EIF3C
mRNA結合，以m6A依賴的方式增加EIF3C的翻譯，同時促進整體蛋白合成，從而促進卵巢癌的發生和轉移。本文確定了對卵巢癌進展至關重要的新的YTHDF1-EIF3C軸，為開發癌癥治療提供新的靶點。
圖7 YTHDF1介導的EIF3C翻譯在卵巢癌中的作用
云序生物RNA修飾特色
云序生物作為國內最早做m6A的科研平臺，至今用戶已發表10多篇m6A相關文章，其中多篇影響因子超過10分。云序生物RNA修飾高通量測序產品覆蓋面廣，包括編碼mRNA和非編碼lncRNA，circRNA，microRNA等分子。云序生物既提供針對單個分子的m6A測序，也提供一次檢測多種RNA分子m6A修飾的全轉錄組測序，此外公司長期致力于提供優質前沿表觀研究測序產品，結合最新科研熱點繼m6A、m5C、m1A之后，隆重推出多款RNA新修飾，不僅有m7G測序，還包括m3C測序、ac4C乙酰化測序和2'-O-甲基化測序，打造了全修飾和全分子覆蓋的研究平臺。
云序生物國內獨家提供RNA修飾測序一站式服務
云序生物提供比色法檢測整體m6A修飾水平、RNA修飾測序、MeRIP-qPCR驗證、RIP和RNA pull-down機制等研究服務。2016年至今，檢測樣本數量累積超過5000+，MeRIP富集成功率高達98%以上。為解決客戶樣本量少的問題，云序早已經推出超微量MeRIP測序技術，500ng總RNA即可完成測序。特殊樣本如血清，血漿，外泌體和石蠟等也可進行RNA修飾測序。
云序生物m6A RNA甲基化測序技術服務流程：
利用m6A特異性抗體，通過免疫共沉淀技術（MeRIP方法）特異性富集發生甲基化修飾的RNA，與不處理組（Input）做對比，對m6A修飾進行高通量測序和peak峰定位。
