酶和酶作用底物
（一）酶的要求：
一個酶蛋白分子每分鐘可催化10 3 ～10 4 個底物分子轉變成有色產物。用于標記的酶應符合：
1.酶的活性要強，催化反應的轉化率高，純度高。
2.酶催化底物后產生的產物易于判斷或測量，方法簡單易行、敏感和重復性好。
3.作用專一性強 ，酶活性不受樣品中其他成分的影響，受檢組織或體液中不存在與標記酶相同的內源性酶或抑制物。用于均相酶免疫測定的酶還要求當抗體與酶標抗原結合后，酶活性可出現抑制或激活。
4.易與抗體或抗原偶聯 ，標記后酶活性保持穩定，且不影響 標記抗原與抗體的免疫反應性 。
5.酶、輔助因子及其底物對人體無害 ，酶的底物易于配制、保存，酶及其底物應價廉易得。
（二）常用的酶
1.辣根過氧化物酶（HRP）：
目前酶聯免疫吸附試驗中應用最廣泛 的標記用酶。
由無色的糖蛋白(主酶)和亞鐵血紅蛋白(輔基)結合而成的復合物。
輔基是酶活性基團 ，而主酶則與酶活性無關 ，HRP的純度用RZ(HRP分別在403nm和275nm處的吸光度比值)表示，RZ值應大于3.0 。
RZ值僅說明血紅素基團在HRP中的含量 ，并非表示HRP制劑的真正純度，而且RZ值高的HRP并不意味著酶活性也高，RZ值與酶活性無關 。
酶活性以單位U表示： 即1分鐘將1μmol底物轉化為產物所需的酶量。酶變性后，RZ值不變但活性降低 ，因此使用酶制劑時，酶活性單位比RZ值更為重要。
2.堿性磷酸酶（AP）：
大腸桿菌來源 的AP分子量80kD，酶作用最適pH為8.0 ;小牛腸黏膜AP 分子量為100kD，最適pH為9.6 ;后一種AP的活性高 于前者。
3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）：
β-Gal來源于大腸桿菌。因人血中缺乏此酶，以其制備的酶標志物在測定時不易受到內源性酶的干擾 ，從而提高特異性，被用于均相酶免疫測定 。
（三）常用的底物
1.HRP的底物
（1）鄰苯二胺（OPD）：
是HRP最為敏感的色原底物之一。OPD在HRP的作用下顯橙黃色 ，加強酸 如硫酸或鹽酸終止反應后呈棕黃色 ，最大吸收峰在492nm 波長。OPD應用液穩定性差，易變色，需新配制后在1小時 內使用，顯色反應過程需避光 ，而且具有致癌 性。
（2）四甲基聯苯胺（TMB）：
TMB經HRP作用后變為藍色，加入硫酸終止 反應后變為黃色 ，最大吸收峰波長450nm。TMB穩定性好，成色無需避光 ，無致突變作用，是目前ELISA中應用最廣泛的底物 。缺點是水溶性差 。
(3)其他：
5-氨基水楊酸(5-ASA)和2，2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)。
2.AP的底物
常用對-硝基苯磷酸酯（p-NPP） ，p-NPP經AP作用后的產物為黃色 對硝基酚，最大吸收峰波長為405nm。
3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）的底物
常用4-甲基傘酮基-R-D半乳糖苷（4-MUU），酶作用后，生成高強度熒光 物4-甲基傘形酮(4-MU)，其敏度性較HRP 高30～50倍，但測量時需用熒光計。