細胞凍存步驟怎么做才更好？

細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。利用凍存技術將細胞置于 -196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復蘇細胞用于實驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用。

為什么要進行細胞凍存

連續培養的細胞系容易發生遺傳漂變，有限細胞系終會發生衰老，所有培養的細胞都易受到微生物污染，即使運轉情況很好的實驗室也會遇到設備故障的問題。由于已建立的細胞系是一種寶貴資源，更換細胞系成本高昂，而且耗費時間，因此，十分有必要將細胞冷凍起來長期保存。除此之外，還可以利用細胞凍存的形式來購買、寄贈、交換和運送某些細胞。

培養細胞凍存方案

以下實驗方案介紹了培養細胞凍存的一般流程。詳細的實驗方案，必須參閱針對具體細胞的產品說明書。

實驗前準備

用具紫外照射消毒（30min）：無菌培養瓶，15ml 離心管，移液管，移液槍，槍頭。采用通風機通風 3min。以 75% 酒精擦拭操作臺和雙手，準備好冰盒，離心機調節至 800rpm，5min。
配制細胞凍存液：凍存液應該提前配置，于 2℃至 8℃下儲存，直至使用。凍存液常規通常配比為基礎培養基：血清：DMSO=7:2:1。加大凍存液中血清量有利于某些脆弱的肝細胞或珍貴的細胞的保存，可調整為血清：DMSO=9:1。

胰蛋白酶 /EDTA 消化

從培養箱中取出待傳代的細胞（將蓋子擰緊），75% 酒精進行瓶口消毒，吸掉培養細胞的舊培養基，PBS 緩沖液洗去殘留的舊培養基，加入消化液，放入顯微鏡下觀察，待所有細胞變圓后立即拿入超凈臺內，加入細胞完全培養基中止消化，消化時間為 1-5min，具體以細胞而異，采用無菌吸管輕輕吹打細胞表面，注意吹打全部培養表面，取所有的細胞懸液放入干凈的 15ml 離心管內，每分鐘 1000rpm，5min。

細胞凍存

取出凍存管，注明細胞名稱，代數，日期。離心后，以無菌吸管吸棄上清，不要吸到底部的細胞沉淀。將細胞沉淀與凍存液充分混勻，根據計數結果，將細胞總數調節成細胞數量為 5-10*10⁵/ml 為宜。將細胞凍存懸液分裝進細胞凍存管中，一般 2ml 的凍存管中裝入 1-1.5ml 凍存液為宜。嚴密封口后，使用可控制降溫速度的冷凍裝置冷凍細胞，使溫度每分鐘大約降低 1℃。或者，將裝有細胞的凍存管放入異丙的醇凍存盒中，然后將凍存盒置于 –80℃條件下過夜。若無凍存盒及其他凍存裝置，可以先將凍存管置于 4℃ 30min，再 -20℃凍存 1h 直至完全冷凍，再轉移至 -80℃冰箱過夜。第二天將已經冷凍的細胞轉移到液氮容器中，置于液氮上方的氣相空間中儲存。

注意事項

凍存細胞系以備將來之用時，必須遵守以下原則。我們建議您嚴格遵守您所用細胞系附帶的操作說明，以便獲得很棒結果。

? 在細胞處于生長期密度達到 70-90% 的情況下進行培養細胞的凍存，并且細胞傳代盡可能靠前。確保凍存前活細胞百分比至少為 90%。請注意jia凍存條件取決于所用細胞系。

? 細胞應緩慢冷凍，可使用可控制降溫速度的低溫冰箱或者低溫冷凍容器，使溫度每分鐘大約降低 1°C。

? 必須使用推薦的凍存培養基。凍存培養基中應含有 DMSO 或者甘油等冷凍保護劑。冷凍保護劑可降低培養基的冰點，并可減緩冷卻速度，大大降低冰晶形成的危險 (冰晶可損傷細胞，導致細胞死亡)。注：DMSO 可促進有機分子進入組織。操作含 DMSO 的試劑時，應采用與此類物質安全危害相適應的設備和操作規范，并應按照當地法規處置此類試劑。建議可使用廠商生產的無血清細胞凍存液，使用方便，復蘇率高。

? 注意冷凍保護劑 DMSO 的品質：DMSO 應為試劑級等級，無菌且無色，以 5-10ml 小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。

? 將冷凍的細胞于–70℃以下溫度儲存；溫度高于–50℃時，冷凍的細胞將開始變質。

? 必須使用無菌凍存管儲存冷凍的細胞。裝有冷凍細胞的凍存管可浸于液氮或者在液氮上方的氣相空間內保存。生物危害性物質必須儲存在液氮上方的氣相空間內。將密封的凍存管置于氣相空間儲存可避免凍存管發生爆炸。如果使用液氮進行儲存，必須注意玻璃和塑料凍存管有發生爆炸的危險，應佩戴面罩或護目鏡。

? 所有與細胞接觸的溶液和設備均應為無菌狀態。必須采用正確的無菌技術，并且在層流通風櫥內進行。

? 實行細胞慢凍的原則：緩慢凍存，可使細胞逐步脫水，細胞內不致產生大的冰晶；相反，結晶就大，大結晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。而復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。