基因轉移的方法

　　基因轉移是用物理的、化學的或生物學的方法將目的基因導入受體細胞并使之表達的一種技術。

　　物理方法

　　包括顯微鏡注射法、電脈沖介導法。顯微注射法是應用特別的玻璃顯微注射器在顯微鏡下把重組DNA導入靶細胞；電脈沖介導法又稱電穿孔法，是指在高壓電脈沖的作用下，使細胞膜上出現瞬間微小的孔洞，從而介導不同細胞之間的原生質膜發生融合，使外源DNA通過細膜上出現的瞬間小孔而進入細胞。

　　化學方法

　　有DNA-陽離子-二甲基亞砜法。基因轉移的生物學方法包括細胞融合法、脂質體介導法、原生質體融合法等。除以上三種方法外，又出現了顆粒轟擊技術，就是將外源DNA包被在金屬上，在電場中包被DNA的金屬顆粒獲得能量并以高速度運動，穿入靶細胞組織或器官內，由于這種金屬顆粒可以涂成薄膜狀，所以可實現較多細胞的基因轉移同時發生，改進了其它物理方法基因轉移效率低的缺點。

　　盡管物理法、化學法及生物學法在基因轉移中被廣泛應用，但由于基因轉移效率較低，在短時間內難以取得基因治療所需要的108~1012個轉化細胞，因而在基因治療的應用中仍然具有一定局限性，雖然對其進行了一些改造，如顆粒轟擊技術的處理和應用，但也不能完全克服以上缺點，故而在基因治療中不得不救助于其它技術，目前被廣泛應用的一種技術就是逆轉病毒載體技術（RMGT）。

　　逆轉錄病毒介導的基因技術

　　是目前將外源基因導入細胞的最有效的方法。此系統包括重組逆轉錄病毒載體和包裝細胞兩個部分，廣泛應用的逆病毒載體LNL6是以Moloney鼠白血病病毒（MO-MLV）改建的。該病毒為RNA病毒，感染細胞后，其基因組RNA經逆轉產生雙鏈DNA拷貝插入宿主染色體形成前病毒，前病毒轉錄產生正鏈即為病毒基因組RNA。整個基因組從5′端到3′端依次是：5′長末端重復順序（LTR）編碼病毒內部結構蛋白的gag基因，編碼蛋白的pol基因，編碼外殼蛋白的env基因以及3′LTR和一個介子5′LTR和gag基因之間的包裝信號。將病毒蛋白編碼區gag、pol、env全部切除，代之以外源性目的基因即改建為病毒載體，保留了LTR和包裝信號，是一種復制缺陷性病毒。同時，設計一種包裝細胞系，其內含有輔助病毒基因組，即為包裝信號缺乏的MO-MLV。當逆轉錄病毒載體進入包裝細胞系時，載體基因就被包裝形成完整的病毒顆粒，于是包裝細胞系就成了制造病毒載體的生產細胞系。將靶細胞與生產細胞系其同培養或是收集含有載體病毒的生產細胞系上清液與靶細胞一起孵育，即可有效地進行基因轉移。逆轉錄病毒載體技術的優點在于轉染譜廣，可感染包括人體在內的多種動物細胞類型，一次可感染大量細胞，轉染率高達100%，轉染的基因可為單拷貝和少數拷貝，能準確地整合到宿主細胞基因組中，整合率高，且能長期有效地表達。

　　RMGT仍有不足之處

　　①載體的滴度較低；

　　②是輔助病毒與載體病毒重組重新獲得包裝信號使病人面臨感染輔助病毒的危險性；

　　③此載體只能整合至分裂相細胞；

　　④此載體容納的外源基因量較少，不利于較大的基因的插入。

　　因此，人們在努力改造包裝細胞系使其日趨完善，并廣泛用于體外及體內的基因治療中。在體外治療中，為了增強腫瘤病人骨髓細胞對化療藥物的敏感性，將骨髓細胞和帶有mdrI基因的逆轉錄病毒在體外共同培養后回輸體內，獲得了很高的療效；在體內治療中，用HSV-tk基因構建的逆轉錄病毒感染成纖維細胞后被直接注入鼠腦神經膠質瘤細胞中，再給予GCV治療，轉染了HSV-TK基因的膠質瘤細胞對GCV的易感性使得腫瘤完全消退了，目前，這項實驗的臨床應用階段尚未報道。