獸醫體外診斷的趨勢—

發布時間：2021-06-23 17:06 原文鏈接：獸醫體外診斷的趨勢——分子診斷

寵物已成為現代人的重要家庭成員，圍繞其吃穿用度、生老病死，形成了一條千億級的“經濟”產業鏈。其中，需求剛性大、消費支出高的寵物醫療更占據了產業鏈中的核心地位，成了寵物消費中的“大頭”。

寵物醫療服務包括為寵物提供疾病診療和日常保健服務，是寵物行業中僅次于寵物食品的第二大細分行業。按疾病種類劃分，寵物醫療服務包括寵物外科疾病、內科疾病、皮膚病、傳染病診療及寵物免疫等。傳染病是由某些具有致病性的微生物，如細菌、病毒等引起的，能夠在某種動物或多種動物之間傳播的一些疾病。養好寵物的關鍵是疾病的防治，尤其是一些傳染病，其發病急、傳播快，對動物的健康威脅極大。

在隨著人們生活質量的逐漸提升，犬貓在人們生活中扮演角色也日漸重要。并且，隨著飼主的觀念和寵物醫療質量的逐年提升，在動物疾病的診斷的準確度上，也從以前的「盲人摸象」逐漸走向分子診斷的水平。

目前，分子診斷技術以其具有的靈敏度高、特異性強、簡便快速、可進行定性、定量檢測等優勢，已廣泛應用于感染性疾病（包括細菌性感染、病毒性感染、寄生蟲、真菌、人畜共患疾病等）、腫瘤等多個領域。分子診斷的檢測結果對臨床醫療決策的貢獻度進一步提升，檢驗結果的重要性也達到空前的高度。
在寵物傳染病檢測技術方面，分子診斷核酸檢測方法同樣具有極高的靈敏度和特異性，可最大程度縮短傳染病檢測的窗口期。該方法也是人類傳染病臨床確診的黃金方法。

其中以PCR為代表技術的是當前分子診斷最常用的方法。PCR技術是用一對寡聚DNA作為引物，通過變性-退火-延伸這一周期多次循環，使目的DNA得到擴增，具有高靈敏性和高特異性的優勢。

而實時熒光定量PCR實現了PCR從定性到定量的質的飛躍，實時熒光定量PCR技術（將熒光基團加入到PCR反應體系中，借助熒光信號，累積實時監測整個PCR的進程）不僅具有傳統PCR的優勢，還具有特異性強、靈敏度高、重復性好、反應速度快、定量準確和自動化程度高等特點，成為國際公認的核酸分子定量的標準方法。

實時熒光定量PCR可以早期、精準的診斷寵物疾病

在目前的寵物臨床工作中，廣泛存在著對一部分病原診斷困難或者不能精確診斷的問題。具體表現在以下幾個方面：

1、現有的診斷技術靈敏度低

如：常見用于病毒診斷的膠體金試紙。雖然膠體金試紙可以提供快速診斷，但是該種方法是從蛋白水平對病原進行檢測，存在一定的交叉反應和動物自身抗體干擾，導至臨床應用的過程中出現假陽性和假陰性的結果；

2、疾病的早期診斷（如潛伏期）和抗原要求較高的疾病

如：使用傳統的診斷技術（膠體金試紙和ELISA檢測方法）無法提供準確的診斷依據。如臨床上常見犬瘟熱和細小病毒；

3、臨床上有很多的病原沒有商品化的便捷的試劑商業化生產

這一部分的病原診斷（如貓傳染性腹膜炎）目前在獸醫臨床工作中還不能做到在醫院內診斷。如果需要做血涂片、糞檢的疾病，導至主觀性較強，易產生漏檢的現象；

4、在疫病防治過程中

如注射疫苗是預防犬貓病毒性疾病的主要措施，但是血清學檢測出的抗體很難區別是疫苗免疫還是病毒感染產生的，而PCR能夠精準的檢測病原體；

5、臨床上還有一些病原在微量時存在診斷困難的情況

如小巴貝斯蟲等疾病。

因此PCR（尤其是實時熒光定量PCR）使這些疾病的精準診斷成為現實。

農業部《2013年國家動物疫病監測與流行病學調查計劃》的要求，以及我國現行的寵物疾病診斷國家標準中頒布了《犬細小病毒診斷技術（GB/T27533-2011）》和《犬瘟熱診斷技術（GB/T27532-2011）》國家技術標準，明確將犬細小病毒和犬瘟熱病毒核酸檢測（而非試紙卡檢測）作為診斷標準，這也說明核酸檢測在動物疫病診斷中的重要地位。

選擇一款合適的PCR產品對于寵物的診斷尤為重要

在臨床工作中，目前有很多PCR供獸醫師們選擇，有核酸免提取的、有等溫擴增的、有液體試劑和凍干試劑的、有全自動PCR，讓獸醫師們無從選擇，到底應該怎樣客觀的看待這些，做到科學的選擇呢，接下來會詳細的闡述。

核酸免提取會導至假陰性的概率增加

核酸提取是分子診斷實驗的“第一步”，是十分重要的環節，因為首先必須把寵物樣品中的核酸提取出來，才能進行后續的檢測，可見核酸提取的重要性。核酸提取具有兩大目的：提純（消除樣本中干擾物質）和濃縮（提高樣本中核酸濃度）。因為，對于PCR所檢測樣品（血清、全血、細胞保存液和糞便等）中有很多干擾物和抑制物，核酸含量低，直接檢測核酸難度高，靈敏度差。因此檢測之前，需要將樣品中的核酸裂解，提純并濃縮，也就是核酸提取。這是業界的主流做法。

比如臨床上一些鼻咽拭子和口腔拭子的洗脫液，成分很簡單，幾乎是生理鹽水+少量分泌物+大量游離的病毒，可以不進行核酸提取直接擴增。貓的皰疹病毒FHV-1用拭子在口鼻采樣就能檢出。如果拭子的洗脫液比較干凈，可以省去提純這一步，但是不經過濃縮，降低了檢測的靈敏度。

此外，復雜樣本必須要進行核酸提取。比如貓的冠狀病毒（FCoV）大多檢測的是貓的腹水，腹水樣本非常粘稠，里面蛋白很多，無法直擴檢測。這種樣本免提取直接擴增就不是靈敏度下降的問題了，而是無法檢測出來的問題。

等溫擴增成本高、較多產品有ZL保護的缺點

等溫擴增儀器簡單，檢測時間快，檢測靈敏度與PCR相仿。但等溫擴增技術多為外國發明，現在還都在ZL保護期內，應用尚不普及，相對來說成本也較高。

真空凍干技術具有諸多優點，是PCR試劑的趨勢

PCR的試劑成分包括純化水、引物、聚合酶、Mg2+、dNTP和探針等成分。這些成分混合后，常溫下會逐漸降解失效。所以液體PCR試劑需要分裝到不同的小瓶-20℃保存，用時再解凍配制。因此，試劑的儲運和操作都比較麻煩。

而真空凍干技術可將試劑內部的水分完全升華掉，同時不破壞有效成分。凍干之后的試劑可以常溫保存，無需冷鏈運輸。使用時加入水就能溶解，然后像正常的PCR試劑使用，因此是PCR試劑的趨勢。

而我們蘇州先達基因，擁有完全獨立自主知識產權的酶促重組等溫擴增技術（ERA技術），通過基因工程對重組酶、外切酶、聚合酶等多酶體系進行改造，建立特殊擴增反應體系，在30-42℃恒溫條件下，20分鐘內，可將微量DNA/RNA的特異性區段在數分鐘內擴增10⁹倍，從而達到可檢出水平。該技術具備PCR擴增的特異性和恒溫擴增LAMP技術的便捷性，準確度極高。

具有可檢測性、靈敏性、快速性以及特異性等優點，反應組分已經混合好并冷凍干燥成干粉狀態，操作簡便，易于保存。且全程自產，相對價格也更有優勢。同時配合其熒光恒溫擴增儀，可以實現核酸現場檢測，不再局限場地、時間或者人員。

分子診斷作為體外診斷技術的第四次革命，應用分子生物學方法，檢測患者（寵物）體內遺傳物質結構或表達水平的變化，繼而作出診斷的技術，它為疾病的預防、預測、診斷、治療和轉歸提供了更為準確的信息。較其他檢測方法相比具有不可比擬的優勢。而PCR作為分子診斷最常用的檢測方法，在寵物的臨床診斷中也會越來越重要。同時也相信我們先達基因的恒溫擴增核酸檢測技術，憑借其檢測快速、價格低廉等優勢，在及時現場檢測市場中會脫穎而出。

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