分子病理診斷，是指應用分子生物學技術，從基因水平上檢測細胞和組織的分子遺傳學變化，以協助病理診斷和分型、指導靶向治療、預測治療反應及判斷預后的一種病理診斷技術，是分子生物學、分子遺傳學和表觀遺傳學的理論在臨床病理中的應用，屬轉化醫學的范疇。分子病理診斷又稱分子病理檢查、分子病理檢測、分子病理技術，稱謂比較混亂。我們認為，如果強調結果(即與疾病的關系)，稱分子病理診斷較好，例如分子病理診斷報告；如強調過程，稱分子病理檢查或分子病理檢測較合適；如強調方法，稱分子病理技術較恰當。從本質上講，凡是基于組織和細胞分子水平上的疾病診斷都是分子病理診斷，這是廣義的分子病理診斷，如免疫組化診斷。但目前公認的是狹義的分子病理診斷，即基于細胞或組織基因水平的病理診斷。本文中就國內分子病理診斷的現狀、存在的問題和應對策略進行探討。
1、我國分子病理診斷發展概況
我國的分子病理診斷基本上與國外同步發展。國內最早的分子病理診斷當首推20世紀80年代的DNA原位雜交。當時王泊云等用32P標記HBV-DNA作探針，在組織切片上進行雜交反應，通過堿基互補原理檢測肝炎和肝癌組織中的HBV感染。隨后出現的是Southern雜交檢測T細胞受體基因和免疫球蛋白基因重排，目的是鑒定T細胞或B細胞的單克隆性增生以早期診斷淋巴瘤。之后，隨著越來越多的腫瘤相關基因被發現，一系列用于檢測癌基因激活和抑癌基因失活的分子病理技術應運而生，如p53基因突變檢測、K-ras基因突變檢測等。本世紀初，腫瘤靶向藥物被用于臨床，靶向治療催生了靶向診斷(又叫藥物伴隨診斷)，一批用于檢測靶向治療藥物靶點的分子病理技術迅速問世，如FISH檢測乳腺癌HER2基因擴增、ARMS法檢測肺癌EGFR基因突變等。現在全國省級以上醫院、解放軍各總醫院、軍醫大學教學醫院基本上都開展了分子病理診斷。因此，最近10年是分子病理診斷蓬勃發展的時期。病理人家收集整理
但我國的分子病理診斷在普及程度、認知程度和規范化程度上與國外相比卻有較大差距。為了盡快與國際接軌，各有關部門和病理專家做了不懈努力。衛生部病理質控評價中心于2011年11月成立了分子病理質控組，并于廣州召開了第一次工作會議。該質控組由復旦大學腫瘤醫院病理科杜祥教授擔任組長，主要任務是指導全國分子病理室的規范化建設，組織分子病理診斷質控。迄今為止，已召開5次工作會議，開展了一系列卓有成效的工作，如建立了全國分子病理質控網站，開展了2批EGFR基因突變檢測質控評比，組織起草了《分子病理診斷實驗室準入基本要求(征求意見稿)》。全軍病理專業委員會也于2012年11月成立了分子病理專業組，舉辦了多期分子病理學習班，以此推動全軍分子病理診斷。地方各省病理質控中心也根據本地情況
陸續開展了分子病理質控工作。
2、我國已經開展的分子病理技術
目前，我國已穩定開展的分子病理技術主要有顯色原位雜交、熒光原位雜交、PCR、熒光定量PCR、基因芯片和DNA測序技術。
2．1 顯色原位雜交 顯色原位雜交(chromogenic in situ hybridization，CISH)技術是分子生物學、組織化學及細胞學相結合產生的一門新興技術，是利用核酸分子單鏈問堿基互補的原理，將地高辛或生物素標記的外源核酸探針與組織、細胞或染色體上待測DNA或RNA互補配對，結合成雙鏈雜交分子，通過過氧化物酶或堿性磷酸酶的呈色反應將待測核酸在組織、細胞或染色體上的位置顯示出來。根據探針種類不同可分為DNA原位雜交和RNA原位雜交。DNA原位雜交主要用于基因定位、特異基因(如病原微生物基因)檢測等；RNA原位雜交則用于基因表達檢測。原位雜交技術的優點是操作簡單，可直接定位組織，價格低廉，信號穩定，儲存方便，可做組織學評價，是目前應用較多的分子病理技術之一。
2．2 熒光原位雜交 熒光原位雜交(fluorescence in situhybridization，FISH)技術基本原理與顯色原位雜交相同，不同之處在于FISH是應用熒光素標記的探針與組織細胞中待測核酸反應形成雜交體，并采用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察信號表達。為了同時檢測多個靶位，在熒光原位雜交技術的基礎上發展起來一種新技術，即多彩色熒光原位雜交(muhicolor fluorescence in situ hybridization，mFISH)。它用幾種不同顏色的熒光素單獨或者混合標記的探針進行原位雜交，能同時檢測多個基因，擴大了FISH技術的臨床應用。FISH技術目前主要應用于染色體和DNA水平上的病理診斷檢測。染色體FISH主要檢測染色體易位、缺失、重復、變異等；DNA FISH主要是檢測基因突變、擴增、易位、缺失。與原位雜交技術相比，FISH更加安全、快速，特異性好、定位準確。
2．3聚合酶鏈反應(PCR) PCR技術是一種在生物體細胞外通過酶促合成特異DNA或DNA片段的方法。其原理是設計特異引物，在Taq DNA聚合酶催化作用下，經過高溫變性、低溫退火和適溫延伸3個步驟反復循環，對某一特定模板的特定區域進行擴增，反應結束后應用凝膠電泳或測序等方法分析產物。因此，該技術可以直接檢測疾病組織、細胞中是否存在某種病毒DNA，同時PCR技術還是基因突變檢測的前期必備技術。
2．4 熒光定量PCR 熒光定量PCR(real time-PCR)技術是近幾年基于普通PCR技術發展的一種新技術。它借助熒光信號來檢測PCR產物，通過熒光染料或熒光標記的特異探針，對PCR產物進行標記跟蹤，在擴增過程中，每經過一次循環，熒光定量PCR儀就會收集一次熒光信號，實時檢測整個PCR進程。用熒光定量PCR法檢測目的基因僅需檢測樣本是否具有擴增信號即可，且PCR反應具有核酸擴增的高效性，可檢測出微小突變。根據探針標記不同可分為TaqMan探針法和ARMS法。TaqMan探針法的關鍵是設計與模板特異性結合的熒光探針，該探針的5’端標記有報告熒光基團，3’端標記有淬滅熒光基團。當探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，儀器檢測不到信號。當PCR擴增時，TaqMan在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針，其3’-5’外切酶活性將探針酶切降解，報告熒光基團與淬滅熒光基團分離，熒光監測系統可接收到熒光信號。因此，每經過一個PCR循環，就有一個熒光分子形成，熒光信號的累積與PCR產物的形成有一個同步指數增長的過程，再通過實時監測整個PCR進程熒光信號的積累來檢測PCR產物。
ARMS法即擴增阻滯突變系統，也稱等位基因特異性PCR，含一對特殊引物(等位基因特異性引物)和一條TaqMan熒光探針。其原理是在DNA序列一端突變位點設計2個引物，突變位點位于引物的3’端，一個相應于正常等位基因序列引物，一個相應于突變基因等位序列引物，再在DNA另一端設計一個共同引物。用PCR對突變基因進行檢測時，只有與突變DNA完全互補的引物才可延伸并得到PCR擴增產物。該方法先通過等位基因特異性引物將DNA突變點富集；然后用設計的TaqMan熒光探針將富集的DNA突變點通過熒光信號的積累檢測出來。因此，ARMS法的靈敏度比TaqMan探針法更高，更容易從大量野生型DNA中選擇性富集低濃度的DNA突變。
2．5基因芯片 基因芯片又稱DNA芯片或DNA微陣列。其原理是在固體載體(硅片、玻片、硝酸纖維素膜)上按照特定的排列方式集成大量已知DNA／cDNA片段，形成DNA／cDNA微矩陣。將樣品分子DNA／RNA通過PCR／RT-PCR擴增、體外轉錄等技術滲入熒光標記分子后，與位于芯片上的已知序列雜交，最后通過掃描儀及計算機進行綜合分析，比較不同熒光在各點陣的強度，即可獲得樣品中大量基因表達的信息。基因芯片技術固定的是已知探針，它能夠同時平行分析數萬個基因，進行高通量篩選與檢測分析，彌補了傳統核酸印跡雜交技術操作復雜、自動化程度低、檢測目的分子數量少的不足。
基因芯片技術是一門新興的技術，由于該技術能在一次實驗中自動、快速、敏感地同時檢測數千條序列，而且獲得的序列信息高度特異、穩定。根據探針類型分為DNA芯片和cDNA芯片，前者用于檢測基因突變，實現腫瘤早期診斷、判斷預后及治療；后者用于檢測基因表達，對腫瘤進行發現性分類和預測性分類。病理人家收集整理
2．6 DNA測序 應用于分子病理診斷的DNA測序技術有直接測序法和焦磷酸測序法。直接測序技術主要是Sanger等發明的雙脫氧鏈末端終止法。其原理就是根據核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，產生A、T、C、G 4組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得DNA序列。直接測序法是基因突變檢測的“金標準”，其優點是結果準確，重復性好，可檢測整個測序范圍內已知和未知突變點；缺點是步驟多，耗時長，靈敏度低，過程不易控制，在檢測已知突變位點方面將逐漸被熒光定量PCR法替代。
焦磷酸測序技術是一種新型的酶聯級聯測序技術，適于對已知的短序列進行測序分析，其可重復性和精確性能與Sanger DNA測序法相媲美，而速度卻大幅提高。其原理是引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放耦聯起來，通過檢測熒光的釋放和強度，達到實時測定DNA序列的目的。焦磷酸測序具備同時對大量樣品進行測序分析的能力，具有高通量、低成本、適時、快速、直觀等優點。
3、我國分子病理的臨床應用領域
隨著分子病理技術的蓬勃發展，越來越多的疾病相關分子改變被發現并逐步應用于臨床實踐中。自21世紀以來，分子病理診斷逐漸受到我國病理學工作者的認可和重視，并逐步在大醫院病理科開展起來，特別是在遺傳性疾病、感染性疾病、腫瘤等方面分子病理診斷已取得了長足的進步。
3．1 遺傳性疾病的診斷與分型 分子病理診斷在遺傳性疾病的診斷和分型方面凸顯特長，通過對患者染色體、基因的檢測進行遺傳病篩查和診斷，并可對家族遺傳病的發生進行預測。目前，國內主要通過染色體核型分析、熒光原位雜交技術、熒光定量PCR技術等檢測染色體畸形，輔助進行產前遺傳性疾病的篩查。通過DNA直接測序、熒光定量PCR、免疫組化技術等檢測相關基因的結構、表達的變化，輔助進行神經系統、生殖系統等遺傳性疾病的診斷。
3．2感染性痰病病原體的檢測 在感染性疾病的臨床應用方面，采用原位雜交、PCR-斑點雜交對人乳頭狀瘤病毒(HPV)DNA檢測，采用熒光定量PCR技術檢測結核桿菌DNA，采用PCR技術檢測各型肝炎病毒DNA或RNA，采用熒光定量PCR技術檢測人類單純皰疹病毒(HSV)DNA、肺SARS病毒RNA感染，采用原位雜交檢測EB病毒(EBV)編碼的小RNA(EBER)等，這些檢測已在感染性疾病的診斷及對療效進行評價方面取得了很好的效果。
3．3腫瘤的病理診斷與臨床應用 分子病理診斷目前在腫瘤的研究中應用最為廣泛，已涉及到腫瘤易感基因檢測與早期診斷、腫瘤輔助診斷、個體化用藥伴隨診斷、腫瘤預后評估等多方面。單獨遺傳因素造成腫瘤的概率<5％。腫瘤的發生主要是遺傳基因和環境因素共同作用的結果，其中遺傳基因是內因，與人體是否具有腫瘤易感基因有關。腫瘤易感基因檢測就是針對人體內與腫瘤發生、發展密切相關的易感基因進行的，它可以檢測出人體內是否存在腫瘤易感基因或家族聚集性的致癌因素，根據個人情況給出個性化的指導方案。腫瘤易感基因檢測特別適合家族中有癌癥病例的人群，可以幫助這類人群提前了解自身是否存在腫瘤易感基因。已知的腫瘤易感性基因有Rbl、WTl、APC、BRCAl、hTERC和Ras等，分別與視網膜母細胞瘤、Wilms瘤、家族性腺瘤性息肉(FAP)、乳腺癌、宮頸癌、消化道腫瘤、泌尿系腫瘤、血液腫瘤等相關。采用DNA直接測序、熒光定量PCR、免疫組化技術等檢測相應基因的改變，可評價個體患病風險，進行疾病的早期預防和診斷。另外，通過熒光原位雜交技術檢測染色體結構和數目的異常，也可早期發現膀胱癌、尿路上皮癌等惡性腫瘤的發生，篩選出腫瘤易感人群。腫瘤相關病原體的檢測，如HPV與宮頸癌，EB病毒與鼻咽癌、淋巴瘤，肝炎病毒與肝細胞癌等均可作為常規技術檢測，已在大醫院甚至中等規模醫院開展起來。
在腫瘤輔助診斷方面，目前在軟組織和骨腫瘤、淋巴造血系統腫瘤及腫瘤的分子分型中應用最為成熟。在以滑膜肉瘤和骨外尤文肉瘤／外周原始神經外胚層瘤為代表的一些軟組織腫瘤中，存在特異性的染色體易位及其相應的融合性基因，采用熒光原位雜交技術可檢測這些具有腫瘤特征的染色體和融合性基因，不僅有助于了解腫瘤的發生和發展機制，而且有助于臨床病理的診斷和鑒別診斷。使用BIOMED-2引物，以PCR技術為基礎的基因重排技術在淋巴瘤診斷中已占有非常重要的輔助診斷作用，而熒光原位雜交技術檢測染色體易位及其相應的融合性基因已對淋巴造血系統腫瘤的分型、預后判斷、治療藥物的選擇具有決定性作用。如MALT基因斷裂檢測與黏膜相關淋巴組織淋巴瘤，bcl-2／IGH基因融合檢測濾泡性淋巴瘤，CCNDl／IGH融合基因與套細胞淋巴瘤，BCR／ABL融合基因確診慢性粒細胞白血病及指導格列衛使用等。分子分型是乳腺癌研究中最為成熟的應用，通過基因表達譜研究，可將乳腺癌分為管腔A型、B型，HER-2陽性型，基底樣型。
通過DNA直接測序、熒光定量PCR技術檢測基因突變、熒光定量PCR、免疫組化技術檢測基因表達、DNA直接測序、熒光定量PCR技術檢測基因多態性、熒光原位雜交技術檢測基因擴增等，可指導腫瘤靶向治療、內分泌治療和腫瘤個體化化療。目前應用最為廣泛的如乳腺癌、胃癌HER-2基因的擴增與化療方案的選擇，EGFR基因突變與肺癌靶向性酪氨酸激酶抑制劑(如易瑞沙、特羅凱)治療，EML4-ALK基因融合、ROSl基因重排、MET基因擴增與克唑替尼治療，K-ras基因突變檢測篩選適合EGFR抑制劑治療的患者，C-kit、PDGFRA基因型預測imatinib治療的反應，Top2A基因異常與化療療效，焦磷酸測序檢測MGMT基因啟動子區甲基化預測膠質瘤中替莫唑胺的療效等。病理人家收集整理
基因表達譜研究在腫瘤預后評估方面起著巨大的推動作用，如乳腺癌21基因檢測預測早期乳腺癌復發風險及化療獲益情況，14基因與肺癌的預后。另外，諸如外周血循環腫瘤細胞的檢測與腫瘤的復發與轉移等技術也逐步在國內獲得應用。
4、問題與對策
4．1 管理層面的問題
4．1．1發展不平衡 ①地區發展不平衡：目前我國的分子病理檢查主要集中于大城市和經濟發達地區，邊遠地區和經濟欠發達地區開展較少；②醫院發展不平衡：現在的情況是大醫院優于小醫院，以三級甲等醫院為主，縣級以下醫院的分子病理幾乎為空白。雖然省級以上醫院大多開展了分子病理診斷，但有的醫院技術項目全面、系統，而有的醫院只開展了顯色原位雜交。不平衡的原因一是病理科主任對分子病理診斷的重要性認識不到位，不主動作為；二是臨床醫師對分子病理診斷的重要性認識不到位，不支持不配合；三是醫院領導對分子病理診斷的重要性認識不到位，不重視不投資。對此，行業協會如醫學會病理分會、醫院協會臨床病理管理專業委員會、醫師協會病理科醫師分會有責任做好宣傳和推動工作，要利用各種機會和場合宣傳分子病理診斷對于臨床診斷和治療的重要意義，提高對分子病理診斷的認識。衛生部《病理科建設與管理指南(試行)》(衛辦醫政發[2009]31號)規定：三級綜合醫院病理科應當設置分子病理檢測室，為醫院病理科開展分子病理檢查提供了政策依據，病理科要抓住機遇，主動作為。除三甲醫院外，如果其他醫療機構具備開展分子病理檢查的軟硬件條件和標本來源，也應積極開展。
4．1．2秩序不健全 有的醫院將分子病理檢查項目放在在檢驗科或中心實驗室進行。分子病理診斷是建立在組織和細胞基礎上的高技術項目，只有病理醫師才能在顯微鏡下識別所取的組織和細胞是否為病變組織或腫瘤組織，如果誤將正常組織和壞死組織當做病變組織進行檢查，勢必得到假陰性結果，不僅延誤診斷和治療，還給患者造成經濟損失。在國外，分子病理檢查由病理科的分子遺傳實驗室負責，技術人員具有分子生物學或遺傳學專業背景，檢查數據和資料由病理醫師綜合分析后出具報告。我國的分子病理檢查也應由病理科承擔。目前除醫療機構外，有的生物技術公司出于經濟方面的考慮，也紛紛開展分子病理檢查項目，向社會出具分子病理檢測報告(不是診斷報告)。一方面，他們沒有病理醫師，不能獲得正確組織或細胞；另一方面，我國沒有實行檢查結果互認，這種報告被醫療單位作為治療依據，如果因假陰性或假陽性給患者造成損失，責任難以劃定。我們認為，生物技術公司可以利用自身的資金、設備和技術優勢，與醫療機構病理科聯合建立分子病理實驗室，但最后報告應由醫療單位的病理醫師簽發。
4．1．3收費標準和醫保政策不配套 國家衛計委已經發布了42013版非營利性醫療服務項目》，共有9000余條收費項目，其中包含了比較齊全的分子病理檢查收費項目，各省正在加緊制訂收費標準，2014
年上半年可望出臺。但是醫保部門尚未響應。我們呼吁醫保部門盡快出臺相關政策，將分子病理檢查納入支付范圍。
4．2技術層面的問題
4．2．1技術平臺不規范 在已經開展分子病理檢查的單位中，設備、設施和人員條件千差萬別，主要問題：①從事分子病理檢查醫師未經過分子病理訓練，只會照葫蘆畫瓢地出具檢查報告，不會正確解釋檢查結果，不會分析解決檢查過程中出現的技術問題，因而也不能指導技術員開展實驗工作。②分子病理技術員大部分從病理組織學技術員轉行而來，只接受了簡單培訓就開展工作，沒有分子生物學理論知識，沒有受過分子生物學技術的系統訓練，只會照單抓藥，很難處理實驗中出現的意外情況。③設備不符合實驗要求，比如移液器精度差，不定期校準；用水浴鍋代替雜交儀；離心機轉速不準，運行不穩定等等。④設施不符合實驗要求。分子病理技術對實驗室條件的要求與分子生物學實驗室相同，需要潔凈的空氣、清潔的環境、合格的雙蒸餾水、標準的工作臺、規范的清洗間等。如果從事與PCR擴增有關的分子病理檢查，為防止氣溶膠污染，還應獨立設置標本前處理區、試劑儲存和準備區、標本制備區、擴增區、擴增產物分析區。這些技術問題只能通過管理手段解決，即建立和實行分子病理檢查準入制度。2012年云南省在全國率先將包括分子技術在內的全部病理檢查技術納入二類技術管理，制訂了技術規范和準入條件，所有已經開展和準備開展病理檢查的醫療單位都必須接受技術審核，審核結果由省衛生廳發文公布，通過者辦理項目登記，準予開展；未通過者不予登記，不得開展。該措施有力地促進了云南省醫療單位病理科建設和發展。國家衛計委病理質控評價中心已組織有關專家制訂了《分子病理診斷實驗室準入基本要求》，對人員、技術、設備、設施的準入以及實驗室的質控、管理提出了明確要求。目前該文件正在征求相關人員和領導機關意見，相信該準入制度的實施將有效規范全國分子病理實驗室的建設。
4．2．2質量控制和監督不到位 以前開展分子病理檢查的單位，其質量控制有的由本實驗室自發進行，缺乏室間比對和行業監督；有的則根本不進行質量控制。這種情況直接影響分子病理檢查結果的可信度，也是有些單位的分子病理檢查得不到，臨床認可的重要原因。衛計委病理質控評價中心依托復旦大學腫瘤醫院開展了2批EGFR突變檢測的質控，取得很好效果，但參加單位均是出于自覺，對不參加的單位或參加但不合格的單位沒有懲戒措施。要想徹底解決這一問題，必須建立全國統一的分子病理質控體系，制訂質控標準和獎懲措施，由衛生行政部門發布、質控中心組織實施和監督。病理人家收集整理
4．3拓展問題
4．3．1應用范圍的拓展 如上所述，目前分子病理診斷只應用于部分領域，還有許多疾病與分子病理診斷無緣，主要原因是我們不知道這些疾病的發生、發展過程中存在何種分子遺傳學變化。我們相信，隨著對疾病發生、發展的分子機制深入研究，必將有一些關鍵的基因變化被揭示出來，分子病理診斷的范圍必將由此而延伸。現階段的分子病理診斷主要是單個標記物的檢測，但疾病的發生特別是腫瘤是眾多基因共同作用的結果，采用單基因標記物進行診斷很難滿足個體化診斷要求。因此分子病理診斷可能從單基因檢測過渡到多基因檢測甚至全基因組的檢測，到那時可根據患者的遺傳背景制定個體化治療方案，從而提高疾病預防和治療的效率。
4．3．2技術的拓展 盡管已經建立的分子生物學技術很多，但真正在分子病理診斷中應用的只有幾種。一種技術從實驗室走向臨床需解決技術的特異性、敏感性和穩定性問題。隨著技術的轉化，將會有越來越多的分子生物學技術應用于臨床。PCR-單鏈構象多態性(PCR-SSCP)、聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(RFLP-PCR)、低變性溫度下的復合PCR(COLD-PCR)技術、富集突變法PCR法、高分辨率溶解曲線、變性高效液相色譜、PCR芯片等技術將逐漸應用于病理診斷和分型，指導靶向治療、預測治療反應和判斷預后，成為常規的分子病理診斷技術。為了節約成本和時間，高通量分子病理檢測技術將是重要的發展方向。