通過對造成檢驗誤差原因的分析,消除或盡可能降低在實驗過程中可能發生的誤差和錯誤結果,提高檢驗的準確性。
藥品是特殊的商品,必須保證其質量,用藥的安全與有效。應用微生物學技術方法監控藥品的有效性及安全性是藥品微生物學檢驗質量保證的基本任務。生物檢驗法是目前微生物檢測的首選法,但此法操作程序多,步驟繁雜,任何疏漏或非標準化的操作條件,均可導致測定結果的誤差。為了使檢驗結果反映藥品的污染狀況,在具體檢驗操作中還需要有一系列的技術措施保證,以便客觀地反映污染程度,提高檢驗結果的準確性,消除或盡可能降低實驗過程中可能發生的誤差和錯誤結果。下面就造成檢驗誤差的原因及控制方法分述如下:
1.培養基的影響
培養基是培養檢測細菌的營養制品,其質量的好壞、穩定與否,對檢驗結果有極為重要的影響。多數廠家生產的干燥培養基一般質量較穩定,須按使用說明條件配制和存放,在規定的效期內使用,對初購的培養基應進行質量檢查。對自配培養基應測定其有效性及靈敏度。在更換配方成分時應進行質量檢查。
1.1 已知茵對照試驗
各種專一和特殊用途的培養基,特別是生化鑒別試驗培養基,在初次使用前,均須用已知的菌株作對照,測定各種生化及其它反應的質量效果,以保證培養基各種鑒別反應的靈敏度和準確性。
1.2酸堿度測定
各種細菌皆有其適宜生長繁殖的pH值范圍,而且有些細菌要求較嚴,因此培養基的pH極為重要。配制過程中測試pH時,必須以冷卻后的溫度為準,否則顏色反應不準;各種培養基所要求的最終pH,是制成品滅菌冷卻后的實際pH。因冷熱的溫差較大,其pH各異。另外,調節pH時應逐漸加堿,防止過量,否則如再加鹽酸矯正,必將會增加培養基內的含鹽量,可降低培養基的使用效果,影響細菌生長。用氫氧化鈉調節的弱堿性培養基,高壓滅菌前pH可比最終pH約高0.2左右,滅菌后基本合適。如用碳酸氫鈉調節pH的培養基,滅菌前的酸堿度應稍低于最終要求的pH值,一般滅菌后稍增高或不變。
1.3培養基的制備
制備后的培養基應及時滅菌,不應放置,避免細菌繁殖。要取均勻的供試液注皿,如取上清液或沉淀物對試驗結果必然有影響。注皿時培養基應在(45±1)℃,高于45℃時易造成細菌受損或致死,低于45℃時易凝固,影響混勻,因此使用前可用水浴保溫效果較好。從供試品稀釋、注平皿、傾注培養基,全部操作應在1 h內完成,避免由于時間過長,導致細菌細胞繁殖或死亡。培養基平皿要及時與皿內供試液振搖均勻,防止細菌重疊生長或成片,影響計數。
2.設備的影響
對各種器械及設備均應有定期檢定與維修記錄,以保證其正常使用。各種培養箱除定期計量認證外,于培養箱內置放最高、最低溫度計,每天觀察溫度波動范圍。玻璃儀器、容量儀器須校驗,玻璃器械均應洗滌干凈,不殘留酸堿及抑菌物質。
3.計數誤差
3.1
在進行菌落計數時,應仔細觀察。菌落生長小而密集,最易發生計數誤差,要仔細判斷。勿漏計細小的、瓊脂內和平皿邊緣生長的菌落,同時應注意細菌菌落與供試品中顆粒、沉淀物、氣泡等的鑒別。必要時用放大鏡或低倍顯微鏡直接觀察或挑取可疑物涂片鏡檢。如仍難區別,可延長培養時間5~7 d,細菌菌落常會生長增大而容易鑒別。
3.2
供試品稀釋液中常含有不溶性原料、輔料,培養基注皿后也可能產生沉淀物,經過培養后有時形成數量很多且難與菌落相鑒別的有形物,為了有利于菌落計數,可在操作時將適宜稀釋級的稀釋液多增加注皿1~2個,注皿后不經培養而放置于冰箱(勿凍結)中,在計數菌落時作為對照。或用0.001%TTC營養瓊脂注皿,經培養后可將細菌菌落與其他有形物區別開來。
(小編注:根據15版中國藥典,營養瓊脂已不使用;TTC已不使用)
3.3
供試品如為微生物制劑,應將有效微生物菌落排除,不可計在菌數內。排除的方法需按該制劑微生物品種而定,并須觀察菌落特征及染色形態。例如,乳酸菌素制劑中含量測定與細菌總數測定分別采用不同方法加以區別。
3.4
菌落生長呈蔓延趨勢者,細菌點計需在24 h,霉菌點計需在48 h作初步點計(點計霉菌菌落時,動作宜輕,勿反復翻轉平板或造成震動,使早期形成的孢子散落在平板的其它部位,又萌生新的霉菌菌落,導致計數誤差。
3.5
由于培養中一些菌落蔓延生長而影響另一些菌落生長,甚至掩蓋了一些菌落,干擾計數。防止菌落蔓延方法如下:
(1)加0.001%1Tc營養瓊脂在傾注培養基前,在每1000 ml營養瓊脂內加入滅菌1%TIC溶液1 ml(最終濃度為0.001%,混勻后傾注平皿)。
(2)開蓋干燥將已凝固的瓊脂平板開蓋,倒置斜放于凈化工作臺上,開機1~2 h后合蓋,再放培養箱中。
(3)換陶瓦蓋將已凝固的瓊脂平板蓋換上新近經干熱滅菌后的陶瓦蓋。
3.6
當高稀釋級平均菌落數大于或等于低稀釋級平均菌落數時,應以培養基稀釋法重新測定。
4.無菌室方面造成的誤差
無菌室的微生物評估是對環境監控不可缺少的指標,它涉及到潔凈狀況,滅菌消毒狀況等的有效性,并能有效檢驗操作者對控制環境中微生物狀況足夠造成影響的操作行為。
4.1 定期檢查無菌室的空氣是否符合規定
無菌室常用臭氧消毒器產生的臭氧氣體,對空氣進行有效消毒,殺菌效果不受物體遮擋影響,消毒無死角。臭氧在常溫下自行逐漸分解為氧,半衰期為20一30 min,分解過程中產生十分活潑具有強烈氧化作用的單氧原子、氧化離子團,能在瞬間殺滅細菌、病毒、霉菌等微生物,是公認的快速、高效、廣譜、安全的殺菌劑。為了確保環境的無菌狀況,操作前應對操作環境的無菌狀況進行監測,最常用的方法為菌落計算法:將經過預培養的普通瓊脂培養基的無菌平皿3個,分別放置工作面的左、中、右處,開蓋,暴露30 min后,置30~35℃培養48 h,平皿內的平均菌落數少于1個。如超過,應立即停止使用,需徹底消毒滅菌。
4.2嚴格無菌操作
正確而熟練地掌握無菌技術是準確完成檢驗工序,得到可靠結論的前提。無菌室內僅存放最必須的檢驗用具,保持固定位置,不隨便移交。在潔凈室中最關鍵的污染源是人員,污染率取決于無菌操作區操作者的操作活動。操作時應在近火焰區操作,而且在所有操作中均不應大幅度或快速動
作,以免攪動空氣中塵埃微粒。
5.被測藥物性質的影響
5.1供試液的制備
按供試品的理化特性與生物學特性可采取適宜的方法制成供試液。制備供試液時,力求均勻分散。因為測定中一個細菌可能繁殖成一個菌落,而一群也可能只形成一個菌落,測定時與勻質方式、條件關系極為密切,分散充分時,菌落生長數多,反之菌落數就少。
5.2供試品的抑菌性
很多藥物有抑菌或殺菌的作用。檢驗結果的準確性,主要取決于供試品本身在試驗條件下是否抑制被檢微生物的生長繁殖。有抑菌作用的檢驗結果是不準確的,應排除其抗菌作用。對含抑菌成分的供試品來說,供試品按常規檢查法,加入規定量的對照菌,不能檢出時,該供試液須按以下方法之一或兩種以上方法聯合處理后,依法檢查。同時做陽性和陰性對照。常用的方法有:稀釋法、中和法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法。
(小編注:2015版中國藥典已刪除離心沉淀集菌法)
6.抽樣
抽驗部分樣品推斷整批藥品的微生物質量,是藥品微生物限度檢驗的基本任務。藥品微生物檢驗不同于化學藥品的含量測定,因為污染于藥品中的微生物具有特殊性:
第一,藥典中以活的微生物作為檢驗對象。
第二,分布的不均勻性。在一個批號內產品有的被污染,有的不茲污槳,分方萬勻;在被污染的部分中,有的數量極多,有的較少,種類上可以復雜或較單一。
這種不均勻性源于污染原的復雜性,有原輔料污染、工藝污染、空間污染和操作人員污染等等構成污染量的多少差異,形成不均態。再者,微生物具有族團性,族團大小、緊密程度是可遺傳的,族團的分散性差異極大,該特點無疑強化了不均勻性。正因為以上這些特點,抽樣方法、抽樣數量、抽樣次數等抽樣狀況很大程度上決定著檢驗的結果。遵循隨機原則的概率抽樣可以保證抽選出代表性較高的樣本,使樣品具有代表性,保證樣本推論總體的可靠性。