免疫組化的操作步驟

　　一 免疫組化（SP法）操作步驟

　　1． 切片常規脫蠟至水。如需抗原修復，可在此步后進行

　　2.緩沖液洗 3min/2 次。

　　3. 為了降低內源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色，將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分鐘。

　　4. 緩沖液洗 5min/2 次。

　　5. 滴加 Ultra V Block ， 在室溫下孵育 5 分鐘以封閉非特異性的背景染色。

　　（注：孵育不要超過 10 分鐘，否則會導致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有 5 － 10% 正常羊血清，這一步可以省略。）

　　6. 緩沖液洗 5min/2 次。

　　7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育1 － 2 小時。（具體孵育時間和溫度由試驗者最終決定）

　　8. 緩沖液洗 5min/2 次。

　　9 ． 滴加 Primary Antibody Enhancer（增強子），在室溫下孵育 20 分鐘。

　　10 ．緩沖液洗 5min/2 次。

　　11 ．滴加 HRP Polymer（酶標二抗） ，在室溫下孵育 30 分鐘。

　　（注：HRP Polymer 對光敏感，應避免不必要的光暴露并儲存在不透明的小瓶中。）

　　12 ．緩沖液洗 5min/2 次。

　　13 ．向 1ml DAB Plus Substrate （或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen），混勻后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分鐘。（具體時間由染色深淺決定。）

　　14 ．自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。

　　操作步驟

　　⑴、石蠟切片脫蠟至水。

　　⑵、 3%H2O2室溫孵育 5-10 分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性。

　　⑶、蒸餾水沖洗， PBS 浸泡 5 分鐘 x2 （如需抗原修復，可在此步后進行）。

　　⑷、 5-10% 正常山羊血清（PBS 稀釋）封閉，室溫孵育 10 分鐘，傾去血清，勿洗。滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小時或 4 ℃ 過夜。

　　⑸、 PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。

　　⑹、滴加適量 生物素標記二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鐘。

　　⑺、 PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。

　　⑻、滴加適量的 辣根酶或堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鐘。

　　⑼、 PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。

　　⑽、顯色劑顯色 3-15 分鐘（DAB 或 NBT/BCIP）

　　⑾、自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。

　　化染色步驟

　　冰凍切片 4-8μm ，室溫放置 30 分鐘后，入 4 ℃丙酮固定 10分鐘，PBS洗，5分鐘x3，用過氧化氫孵育5-10分鐘，消除內源性過氧化物酶的活性。