基因編輯新進展:關鍵酶消除CRISPRCas技術脫靶效應

　　近來全球興起的CRISPR-Cas編輯技術是基于細菌和古細菌天然防御機制的一項技術。與真核生物體內的RNA干擾過程極為相似，CRISPR-Cas 技術能夠特異性切割核酸片段，不過該技術也有可能發生非特異性切割，引起基因組非靶向位點的突變，這一問題越來越受到科研人員的關注。

　　CRISPR-Cas系統的脫靶效應

　　哈佛醫學院的George Church及同事們比較了CRISPR-Cas系統，與以轉錄激活因子樣效應子(TALEs)為基礎的另一種基因表編輯工具在人類細胞中的靶向特異性。重要的是，Church研究小組還提出了一種新方法減少了利用CRISPR-Cas時的潛在脫靶效應。研究成果發表在8月1日《自然生物技術》(Nature Biotechnology)雜志上。

　　CRISPR-Cas系統是通過將短鏈外源遺傳物質整合到宿主基因組中來發揮作用的。這些序列被轉錄并加工成小RNAs，隨后小RNAs可與Cas蛋白復合物一起結合與小RNA序列相匹配的外源DNA或RNA，從而導致入侵核酸遭到序列特異性地切割和破壞。

　　在新研究中，Church和他的研究團隊發現，TAL效應子容許靶序列1-2個堿基對錯配;由單導向RNA(single-guide RNA)和Cas9蛋白構成的復合物能夠容許1-3個堿基對錯配。“這不是一個大問題，但它卻可能會導致一些脫靶效應，”洛克菲勒大學CRISPR干擾專家Luciano Marraffini說。

　　如何解決CRISPR-Cas系統脫靶

　　為了解決這一問題，Church研究小組生成了一系列的Cas9突變體，這些Cas9突變體沒有生成雙鏈斷裂，而是引入了偏移缺口，每個缺口只影響一條 DNA鏈。盡管這一策略實質上造成了雙鏈斷裂，它通常不會導致非同源末端連接(雙鏈斷裂的一種細胞修復機制)引起的插入或刪除。因此，這種方法可能會減少脫靶效應。

　　利用核酸酶系統重新構建基因組并非全新的研究。研究人員過去也曾為了減少脫靶效應，而制造出了另一種基于鋅指核酸酶的基因組編輯工具。今年早些時候，Marraffini和他的合作者們報告稱，可將Cas9轉換為一種切口酶，減少與DNA修復機制相關的脫靶突變。

　　然而，Church的方法是否確實能減少脫靶效應仍有待證明。Sangamo BioSciences公司首席科學官Philip Gregor 說：“Church朝著解決這一問題邁出了第一步。但本文沒有對這一切口誘導雙鏈DNA切割方法的特異性進行評估。解決這一特異性問題非常的重要。”

　　Sangamo 公司當前正在開展臨床試驗，評估用鋅指核酸酶來治療HIV/AIDs。盡管Church指出相比于鋅指核酸酶和TAL效應子，CRISPR-Cas系統要容易100-1000倍，但Gregory仍有所懷疑。“至少以它當前的形式，CRISPR-Cas9系統極易發生重要的脫靶活性，其可能超過期望目標位點的切割水平，”Gregory說。

　　盡管存在這些擔憂，Church的研究還是讓科學團體產生了一些樂觀的看法。“到目前為止已經證實CRISPR-Cas9具有較差的基因組編輯特異性，盡管高效，它走向了垃圾場。這一雙切口方法及時地停住了垃圾車。”

　　專家點評CRISPR/Cas技術

　　上世紀80年代初，科學家們用顯微注射的方法將外源DNA片段導入小鼠受精卵的原核中，構建出了第一個轉基因小鼠。至今原核顯微注射仍然是制備轉基因動物的最常用的方法。然而該方法只能將外源DNA片段導入動物基因組中，無法對體內基因組的特定序列進行特定的修飾。80年代后期，由于小鼠ES細胞及同源重組技術的發展而催生的基因打靶技術使得科學家們可以對小鼠的任何基因序列進行隨意的修飾，基因打靶技術的發展使生命科學的研究發生了革命性的改變，但用此技術制備基因工程動物模型花費較大，過程較長，而且由于基因的修飾是在ES細胞中進行，目前用基因打靶技術只能用于制備基因改變的小鼠和大鼠動物模型。

　　近幾年，生物學家們發現，兩種人工改造過的核酸酶ZFN和TALEN能夠識別并結合指定的基因序列位點，并高效精確地切斷。隨后細胞利用天然的DNA修復過程來實現DNA的插入、刪除和修改，這樣研究人員就能夠隨心所欲地進行基因組編輯。ZFN和TALEN技術結合了原核注射的制備周期短和基因打靶技術的定點修飾的特點，而且可以應用到除小鼠和大鼠之外的其他動物。但其脫靶效應(off target)，也就是把不該切的地方切了的問題仍是一個挑戰。

　　今年初以來，一種新的基因組修飾的技術CRISPR/Cas 受到人們的高度重視。 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是細菌用來抵御病毒侵襲/躲避哺乳動物免疫反應的基因系統。科學家們利用RNA引導Cas9核酸酶可在多種細胞(包括iPS)的特定的基因組位點上進行切割，修飾。 Rudolf Jaenisch 研究組將Cas9與Te1和Tet2特異的sgRNA共注射到小鼠的受精卵中，成功得到雙基因敲除的純合子小鼠，效率高達80%。 他們將Cas9/sgRNA 與帶突變序列的引物共注射，能準確在小鼠兩個基因引入所要的點突變。在ES細胞中他們更是成功的一次敲除了五個基因。與ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas更易于操作，效率更高，更容易得到純合子突變體，而且可以在不同的位點同時引入多個突變。但該系統是否有脫靶效應尚需進一步的研究。

　　傳統的轉基因和基因打靶技術，由于技術穩定成熟，可以對小鼠和大鼠的基因組序列進行各種修飾，目前仍將是模式動物的構建的主要技術。 核酸酶ZFN/TALEN 尤其是CRISPR/Cas技術如果能解決脫靶效應的話，有可能會廣泛應用于小鼠，大鼠及其他模式動物的制備和研究中，成為傳統的轉基因和基因打靶技術的重要補充。