第十屆全國生物醫藥色譜技術學術交流會大會報告(二)

　　2014年4月21日下午，第十屆全國生物醫藥色譜及相關技術學術交流會大會報告在威海召開。在此次生物醫藥色譜大會報告中中國科學院化學研究所的陳義教授，浙江大學的方群教授，山東大學的陳建民教授，賽默飛世爾科技（中國）有限公司的戴振宇先生，島津企業管理(中國)有限公司分析儀器市場部的朱天強先生，北京大學化學與分子工程學院的劉虎威教授和中國科學院生態環境研究中心環境化學與生態毒理學國家重點實驗室的江桂斌院士就樣品分離、色譜技術、質譜技術、分析方法方面作了精彩的報告。

中國科學院生態環境研究中心環境化學與生態毒理學國家重點實驗室 江桂斌院士

　　來自中國科學院生態環境研究中心環境化學與生態毒理學國家重點實驗室的江桂斌院士帶來了題為《Environmental & Food Analysis：Problem & Challenges》的報告。

　　江院士介紹到現在對于環境的惡化，出現了很多新型污染物，包括全氟烷基化合物、短鏈氯化石蠟、多溴聯苯醚和全氟碘烷等。這些新型污染物的分析將面臨著很大的挑戰，這就需要更高效的分離、更完全的電離。

　　江院士指出在環境與食品的分析中，除了更好的選擇性、特異性、準確性、精確度、靈敏度、重復性、回收率和檢出限以外，還需要更多的可靠性。

　　環境與食品污染物分析方法盤點

　　盤點環境與食品污染物的分析方法，江院士表示對于環境污染物，主要有常規污染物、大氣污染物、持久性有機污染物和重金屬表面活性劑高聚物 PPCPs。在重金屬表面活性劑高聚物PPCPs的研究中，通過對智利12.5萬人的調查顯示，18歲以前有砷暴露史，雖停止飲用高砷水，仍會促進成年人 （30-49歲）肺癌的死亡率，金屬元素價態與形態的分析可使用HPLC-ICP/MS、同步輻射EXAFS、多接收高靈敏同位素質譜技術和傅里葉轉換 /高分辨質譜等技術；對于VOCs室內空氣污染物，江院士表示室內環境污染已經引起了33.75%的呼吸道疾病，22%的慢性肺病和39%的支氣管炎、氣 管炎和肺癌，兒童比成年人更容易受到室內空氣污染的危害，在室內空氣污染物中，苯、甲苯等會造成白血病，氡（Rn）是導致肺癌的第二大因素。

　　PM2.5的組成及其復雜，具有30,000種以上的化合物，幾乎包含元素周期表所有元素；比表面積大，幾十平方米/克；形態結構復雜、時空差 異大；可滲透到氣管-肺泡-血管。用公式來表示：SO2+VOC+NOx+NH3+Waters+sunlight=PM2.5。

　　對于PM2.5的測定，有稱重法、β射線法和光散射法。而符合POPs（持續性有機污染物）標準的污染物所占的比例只有2%，POPs的結構復 雜、含量低、毒性差別大，如二惡英有210種、多氯聯苯有209種、多溴聯苯醚有209種，POPs相關研究是最復雜、最困難、最前沿的工作。江院士列舉 了青藏高原中魚的PFOS的分析、中國工人血清中的PFOS和PFOA的含量分析、POPs的毒性效應、有機污染物與糖尿病的關系。

　　面臨的問題和挑戰

　　江院士表示在色譜與質譜聯用研究未知化合物時，除了定性和定量，更多的是要研究它的效應。在毒理學方面，劑量的控制影響著毒性的效應。2002 年美國加州大學Hayes等-證明了復合污染效應的存在，解決了典型劑量-效應的關系和非典型劑量-效應關系，證實了單一的細胞實驗揭示不了復合毒性效 應。在轉化毒理學實驗中，江院士表示毒殺芬種類繁多，具有立體結構，具有32768個同族體，其分析仍是現代有機分析的難題。

　　江院士說：“暴露組學是我們用一個更加整體的觀念來對待污染物的問題，運用生物體生命周期變化，來幫助我們解決問題的方法。”

北京大學化學與分子工程學院 劉虎威教授

　　來自北京大學化學與分子工程學院的劉虎威教授帶來了題為《毛細管電泳-質譜聯用技術的新進展》的報告。

　　劉教授表示CE最成功的應用領域是手性分離、基因測序、物化常數測定和相互作用研究。但是CE-MS還面臨著多種挑戰，包括CE運行緩沖液中的 不揮發鹽抑制離子化，污染離子源；NACE用有機溶劑影響離子化效率，降低靈敏度；MEKC的表面活性劑抑制離子化，污染離子源；CCE的手性選擇劑抑制 離子化，污染離子源；鞘液的稀釋作用和噴霧的穩定性等。

　　劉教授還介紹了一些CE-MS的應用領域，包括CE-MS檢測植物多肽激素研究——結合動態pH連接富集方法；CE-MS分析茉莉酸手性異構體；CE-MS研究抗癌藥物與DNA的相互作用；CE-DART MS聯用技術等。

　　最后，劉教授總結CE-MS面臨嚴峻的挑戰，靈敏度和重現性仍有待提高，接口性能有待改善；CE-MS研究相互作用有優勢；部分填充技術可以部分解決CE-MS的問題；動態pH連接富集有利于CE-MS檢測；CE-DART MS有很好的抗鹽和抗表面活性劑的效果，但靈敏度有待提高；要發揮CE-MS的優勢，還需要繼續研究。

中國科學院化學研究所 陳義教授

　　來自中國科學院化學研究所的陳義教授帶來了題為《一種新型分離介質——光子晶體》的報告。陳義教授分別就為何光子晶體，何為光子晶體，何人何時使用光子晶體用于分離，如何人工制備光子晶體和團隊工作方面作了介紹。

　　為何光子晶體

　　色譜等分離方法正面臨來自各種組學、藥學、環境等復雜樣品分析的嚴峻挑戰。組織大規模分離是一種現行策略但并非很理想。色譜中的范迪姆特方程預示，有兩種核心途徑可提高色譜的分離效率：第一是縮小色譜填料粒徑，毛細管電泳、微流控、超高壓液相色譜因此出現；第二是提高分離介質排布的規整性，但未見確切實例，是故尚有很大的研究機會和發展空間。陳教授組從2004年起開始對其展開了研究，受晶體結構的啟發，研究指向了光子晶體（Photonic crystals 或PCs）。

　　何為光子晶體

　　陳教授講到PCs實際上是一類具有周期性結構的介電物質，在自然界中早就存在，如夢幻富麗的蛋白石，金光閃爍的金龜子，典雅高貴的珍珠，粗俗卑微的貝殼等等。

　　何人何時使用光子晶體用于分離

　　1996年，首先由哈佛大學的Whitesides通過微通道組裝了PCs用于毛細管分離和微流控。

       如何人工制備光子晶體

　　有光刻法、拉制法、打孔法、逐層組裝和蒸發自組裝法，要點是均勻顆粒制備和不同腔道中顆粒的快速組裝。

　　團隊工作

　　陳教授團隊展開了對光子晶體制備研究，發展了快速制備新方法，進而探討了其分離性能，實現了DNA、蛋白質、氨基酸等生物分子的高效高速分離與鑒定，預示了PCs非常有前途。

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浙江大學 方群教授

　　來自浙江大學的方群教授帶來了題為《基于順序操作液滴陣列技術的微流控分析和篩選》的報告。

　　 方群教授首先講到多相微流控技術是指利用多相微流體的物理化學特性和尺度效應，在微流控系統中進行微量微液滴（顆粒）反應器的生成、操控、反應、分析和篩 選。它的突出優勢是超微量、高效、高通量、微型化，應用于高通量藥物篩選，功能材料的高效可控合成，基于單分子和單細胞水平的分子生物學、細胞生物學和合 成生物學研究，臨床檢驗，蛋白質組研究等多個領域。

　　在2010年方教授團隊發展了自動化液滴分析篩選系統——液滴實驗室（DropLab），它引入了液滴生成與試劑加入的新方法液滴組裝，相對芯 片方法，新方法可靈活控制每個液滴的體積和化學組成，DropLab可應用于酶抑制分析，蛋白質晶體條件篩選，單細胞酶活性分析和單細胞DNA提取與凈 化。

　　在前期發展的自動化液滴分析篩選系統——液滴實驗室（DropLab）的基礎上，建立了順序操作液滴陣列（Sequential Operation Droplet Array, SODA）系統。SODA系統利用吸-點-移單元操作的組合可在PL精度水平自動化地完成靈活的液滴操控，有望成為一種通過化微量液體操縱、分析和篩選的平臺，以及進行微量樣品前處理的理想工具，它應用于單分子、單細胞分析，蛋白晶體篩選，組學分析，臨床檢驗和組合化學等。

山東大學 陳建民教授

　　來自山東大學的陳建民教授帶來了題為《在線小時分辨離子色譜技術在PM2.5研究中的應用》的報告。

　　陳建民教授首先報告了PM2.5的研究背景，近年來極端污染事件頻繁發生，最大覆蓋面積超過130萬平方公里，部分地區能見度低于500米。影 響大氣能見度（霾）類型：二次氣溶膠（硫酸鹽、硝酸鹽、銨鹽、有機物、粉塵）；生物質燃燒（富含鉀及OC/EC）；沙塵（長程傳輸與混合機制）；煙花燃放 （富含鉀及硫酸鹽、硝酸鹽）。面臨的挑戰是針對化學組成分析，通常使用濾膜采樣分析，它失去了混合狀態信息；針對新發展起來的在線技術可以辨別氣溶膠顆粒 的化學組成，解析霾形成機制與能見度變化。

在線氣體與氣溶膠分析儀MARGA原理圖

　　霾污染物中由二次轉化而來的占很高比例，高濃度SO2和NO2及高SOR、NOR直接導致大氣中大量的二次硫酸鹽、硝酸鹽氣溶膠的形成。二次氣 溶膠形成機制主要是氮氧化物、硫氧化物轉化率，它呈現酸性，主要成分分析法是通過SPSS軟件建模完成。PM2.5中化學組成濃度變化情況：霾及空氣污染 呈現常態化；秸稈等生物質燃燒和沙塵影響能見度，助推大氣污染加重；區域性灰霾形成后各省市相互影響。

　　最后陳教授介紹了MARGA聯用技術，有：Marga+H-TDMA（吸濕性）；Marga+CRDs（光學特性）；Marga+A-ToF- MS（單顆粒化學組成）；Marga+TEM-EDX（單顆粒結構）；Marga+Fog（霧化學）。在這些方面均取得了很好發展，毫無疑問，MARGA 是一種在線高分辨離子色譜技術研究PM2.5的良好技術，該技術還有良好的改進和發展潛力。

賽默飛世爾科技（中國）有限公司 戴振宇先生

　　來自賽默飛世爾科技（中國）有限公司的戴振宇先生帶來了題為《Thermo Scientific 色譜柱及相關產品在生物蛋白產品寡糖/唾液酸修飾分析中的新進展》的報告。

　　首先戴振宇先生講了pH梯度離子交換色譜分離單抗唾液酸化異構體。戴先生介紹研究聚糖是為了研究治療性蛋白，根據唾液酸化（電荷異構體）單抗分 離研究的一些背景情況，分析比較pH梯度和鹽梯度，強陽離子交換色譜和強陰離子交換色譜，選擇pH梯度-強陽離子交換柱的ProPac SCX-10最優。此外還有四個可以繼續優化的地方：1. ProPac SCX-10與MAbPac SCX-10比較，可以獲得更高分辨率；2.更窄pH梯度范圍內的分離，可以獲得更高分辨率；3. Thermo Scientific商業化的pH梯度流動相CX-1的應用，更加方便，重復性更好；4.應用小顆粒柱縮短分析時間，更快。

　　隨后戴先生報告了Thermo Scientific最新的用于聚糖分析的液相色譜柱。Thermo Scientific 2013年1月推出的GlycanPac AXH-1，適合中性和帶電聚糖；2014年1月推出的GlycanPac AXR-1，是帶電聚糖的最好分離方法，具有超高分辨率；Accucore Amide HILIC，是理想的中性聚糖分離柱。

島津企業管理(中國)有限公司分析儀器市場部 朱天強先生

　　來自島津企業管理(中國)有限公司分析儀器市場部的朱天強先生帶來了題為《在線蛋白質酶切技術》的報告。

　　朱先生表示蛋白質組學研究中酶解技術主要有離心柱、樹脂+離心柱、磁珠和樹脂等多種類型，但是酶切時間最短的離心柱類型還需要15分鐘左右。

　　Dr Fred E. Regnier在2012年發表的文章中提到了Perfinity iDP的發明。Perfinity iDP能夠加速Trypsin酶解和肽段脫鹽（4min digests）；提高酶解的重復性，cv小于10%；降低成本。Perfinity系統采用3柱系統，包括自動酶解，脫鹽和反相色譜。Perfinity iDP能夠將樣品前處理過程減少到20分鐘，高通量達每天超過200個樣品量。在重復性和交叉污染的實驗中，對轉鐵蛋白6次酶解后反相色譜測定的數據表示平均CV=3.69%，42％的序列覆蓋率，樣品前處理時間為44分鐘。在lgG實例中，特異性肽段的LC-MS/MS分析可用于單克隆抗體臨床前研究。

　　朱先生還介紹到Nanotrap是核心殼帶有多孔內部的水凝膠顆粒，包括各種親和選擇器誘餌和體積排阻的外部，這些顆粒在一個快速步驟中充當提供多維富集的分子刷進行簡單地分離富集。最后，朱先生又提到了iMLayer基質沉積系統、iMScope質量顯微鏡和高分辨單細胞成像等技術。

　　第十屆全國生物醫藥色譜技術學術交流會大會報告(一)