納米孔技術有望顛覆DNA測序市場

　　Christopher Mason有一個喜歡在會議上展示的技巧。通過從志愿者手機上收集的化驗樣本獲取DNA，他和同事能在1個小時內現場進行譜系分析，甚至詳細描述出捐贈者一天的生活細節。“我們能從手機上的殘留物預言誰剛吃了一個橘子或者誰吃了豬肉。”美國紐約威爾康奈爾醫學院計算生物學家Mason表示。

　　他利用一種由英國牛津納米孔技術公司（ONT）研發、名為MinION的手持測序設備實現了這種快速分析。MinION會讓DNA長鏈穿過被稱為納米孔的小孔，探測由DNA的4個核苷酸組件引發的電流微小變化，從而閱讀序列信息。Mason的展示是對該設備性能的輕松說明，而早期用戶卻積累了一些引人注目的科學成就。MinION在監控2015年埃博拉病毒暴發上扮演了舉足輕重的角色，并乘船到達過南極甚至進入了太空軌道。

　　不過，大小和一副撲克牌相當的MinION僅在全球測序市場上占據了一小部分份額。這個市場仍由位于加州圣地亞哥的啟迪公司主導。雖然啟迪領先了近10年，但ONT及其用戶正在努力克服技術挑戰——最突出的挑戰是較高的出錯率。與此同時，競爭的企業希望對這種概念上很簡單但技術上很復雜的測序策略稍加創新，從而超越ONT。

　　在傳染病研究人員中最受歡迎

　　事實證明，MinION在傳染病研究人員中尤其受歡迎。例如，伯明翰大學微生物基因學家、MinION早期采用者Nicholas Loman同全球病毒“熱點區域”的同行合作，共同監控埃博拉在西非以及寨卡在巴西的傳播。“他們基本上能在48小時內建立一個測序實驗室使其運行，并且可以把設備打包到攜帶的行李箱里。”加州大學生物物理學家Mark Akeson表示。Akeson開展了納米孔測序法方面的一些基礎性研究，并且是ONT咨詢委員會成員。Loman表示，這種可攜帶性是一種巨大的優勢，但大量的數據輸出可能會難以掌控。“我們在巴西幾乎要成功了，但因為設備過熱，我的蘋果電腦崩潰了。”

　　一些團隊正在探尋臨床微生物學應用。澳大利亞昆士蘭大學生物信息學家Lachlan Coin開發了實時數據分析算法，以便檢測血液樣本中的耐藥細菌。在利用培養細菌開展的早期測試中，Coin團隊能在10個小時內辨別出一個樣本中的所有抗藥基因。Coin介紹說，現在的技術能讓這一時間減半，但利用真實樣本（人類DNA會將細菌DNA淹沒）的做法正令這一過程復雜化。“我認為，再過1年左右，我們將能在6個小時內辨別出病人樣本中的抗藥基因。”

　　其他研究人員正在探尋宏基因組學，目標是全面描述樣本中的所有生物體。原則上，流動細胞中的每個納米孔都能被用于同時檢測不同的基因組。“你可以獲得存在的任何物種——細菌、病毒和人類DNA的完整基因圖譜。”Mason介紹說。他利用納米孔測序對因骯臟出名的紐約地鐵系統開展了宏基因組學調查，并且雄心勃勃地計劃對更加荒涼的環境——包括火星進行分析。Mason同美國宇航局的科學家合作證實，MinION在國際空間站零重力條件下表現良好。他和同事希望，有一天能將該技術用于研究火星，并且為正在進行的尋找地外生命提供幫助。

　　回到地球，佛蒙特大學遺傳學家Scott Tighe在南極麥克默多干河谷運行了MinION。在那里，他的團隊用了兩個多小時對微生物樣本進行了測序。“設備停止運行的原因在于外面太冷了：電池到最后沒電了。”同Tighe就若干項目有過合作的Mason解釋說。

　　瞄準哺乳動物基因組

　　諸如美國國家人類基因組研究所所長Adam Phillippy等納米孔方面的資深專家將微生物基因組組裝視為“一個已經解決的問題”。如今，他們有了更高遠的目標：含有數十億個而非幾百萬個核苷酸的哺乳動物基因組。今年，一個包括Phillippy、Loman和加拿大安大略癌癥研究所生物信息學家Simpson在內的研究團隊報告稱，他們僅利用達到很高準確度的MinION數據便組裝了完整的人類基因組。Simpson介紹說，平均的重疊群大小達到百萬堿基級別，精度值最高為99.44%。搭配使用啟迪公司的短序列技術，該團隊將準確度提升至99.96%，盡管這仍落后于99.99%的金標準準確度。

　　不過，在人類基因組分析的其他方面，納米孔要更加擅長。例如，目前的人類基因組組裝仍不完整，因為高度重復的區域對短序列分析“并不感冒”。一個由加州大學基因組學研究人員Karen Miga領導的團隊證實，納米孔能幫助研究人員填補這些空白。Miga團隊利用150千堿基對序列重構了人類著絲點，即真核生物染色體上高度重復的基因組。對該領域的研究此前一片空白。同Miga開展合作的Akeson預測，離組裝出真正完整的基因組序列可能僅有幾年時間。

　　納米孔分析還非常適合繪制外基因標記——對單個核苷酸進行的微小化學修飾，會影響基因表達。大多數測序平臺利用的是清除這些標記的樣品制備方法，但納米孔平臺可直接分析修飾的DNA。Simpson和來自約翰斯?霍普金斯大學的Winston Timp證實，他們能訓練軟件區分甲基化胞苷酸和正常胞嘧啶的電信號，準確度約為90%。Akeson也實現了類似的成功。“我們能探測到任何試圖看到的修飾。”Akeson表示，“它甚至能區分兩個氫原子之間的差別。”

　　更多期待

　　不過，一些用戶發現，納米孔樣本準備工具具有不可預知性。例如，一些DNA樣本需要廣泛的優化。“一些人做得非常好并且獲得了驚人的成果，但其他人仍在掙扎。”位于馬薩諸塞州的藥物研發公司Warp Drive Bio首席科學家Keith Robison 表示。在去年12月的一次演講中，ONT首席科技官Clive Brown宣稱：“公司正在投入很多努力，為人們提供針對特定樣本類型的調試協議，從而幫助他們優化獲得的樣本。”

　　諸多問題為競爭者帶來了機遇。跟得最緊的是位于瑞士的羅氏公司。2014年，該公司并購了總部位于加州的納米孔初創企業——珍妮亞技術公司。雖然羅氏公司對它的系統秘而不宣，但珍妮亞公司在2016年公開的一份文件中描述了“通過合成開展納米孔測序”的策略。該技術將DNA合成酶同蛋白納米孔配對。這種酶會讀取目標DNA，并且利用帶有化學標簽的核苷酸建立互補序列。在每個堿基被包括進不斷延長的DNA鏈時，它的標簽被釋放并穿過納米孔，從而產生不同的電信號。

　　不過，ONT并未止步不前。和此前的模型相比，其兩個最新的桌上型系統能傳送大很多的數據量。在今年3月發布的GridION基本上可并行運行多個MinION設備。相比之下，PromethION利用的是一種完全不同的流動細胞，并且面向的是人類基因組規模的項目。“很明顯，他們想讓該系統在輸出量方面同啟迪公司的平臺相媲美。”Loman表示。

　　雖然該領域取得了很多進展，但不容否認，納米孔測序占據了支配地位。其低成本、可靠測序的前景令研究人員興奮不已。“作為計算機科學家，我總是非常渴望數據。”Phillippy表示，“所有微生物學實驗室和大學課堂都能產生測序數據的想法非常誘人。”