施一公團隊破解結構生物學最大難題之一

施一公

　　北京時間8月21日凌晨，著名的《科學》雜志在線發表了清華大學生命科學學院施一公教授研究組的兩篇具有里程碑意義的論文，宣布得到了高分辨率的剪接體三維結構和剪接體對前體信使RNA執行剪接的基本工作機理，從而將分子生物學的“中心法則”在分子機理的研究上大幅度向前推進。

　　“這項研究成果的意義很可能超過了我過去25年科研生涯中所有研究成果的總和！”論文發表后，《賽先生》第一時間聯系到了施一公，他振奮地表示：“我此前以通訊作者身份在《科學》、《自然》和《細胞》上發表的文章總共接近50篇，但我覺得這次的意義特別重大！”

　　這兩篇文章的題目分別為“3.6埃的酵母剪接體結構（Structure of a Yeast Spliceosome at 3.6 Angstrom Resolution）”和“前體信使RNA剪接的結構基礎（Structural Basis of Pre-mRNA Splicing）”。第一篇文章報道了通過單顆粒冷凍電子顯微鏡（冷凍電鏡）方法解析的酵母細胞剪接體近原子水平分辨率的三維結構，第二篇文章在此結構的基礎上進行了詳細的分析，闡述了剪接體對前體信使RNA執行剪接的基本工作機理（如下圖）。清華大學生命科學學院博士后閆創業、醫學院博士研究生杭婧和萬蕊雪為兩篇文章的共同第一作者，施一公是兩篇文章的通訊作者。

信使RNA被剪切、連接的原子模型

　　完善分子生物學中心法則

　　為何這兩篇文章如此重要？

　　在分子生物學上，“中心法則”是描述細胞最基礎也最核心的生命活動基因表達的一套規律，于1957年由英國生物學家克里克提出，對中心法則各個環節中重要生物大分子的組成、結構和功能的研究從來都是生命科學家們追逐的前沿熱點。中心法則的發現與闡述伴隨著多個諾貝爾獎的產生。而20多年過去了，其中公認最艱難的部分就是RNA剪接的清晰結構和復雜機理。

　　在所有真核細胞中，基因表達分三步進行，分別由RNA聚合酶(RNA polymerase)、剪接體(Spliceosome)、和核糖體(Ribosome)執行。首先，儲存在遺傳物質DNA序列中的遺傳信息必須通過RNA聚合酶的作用轉變成前體信使RNA (precursor messenger RNA, 簡稱pre-mRNA)，這一步簡稱轉錄（transcription）；其次，前體信使RNA由多個內含子和外顯子間隔形成，必須通過剪接體的作用去除內含子、連接外顯子之后才能轉變為成熟的信使RNA，這一步簡稱剪接（splicing）；第三，成熟的信使RNA必須通過核糖體的作用轉變成蛋白質之后才能行使生命活動的各種功能。描述這一過程的規律被稱為生物學的中心法則，其在生命科學領域具有核心重要性。

　　其中，RNA聚合酶和核糖體的結構解析曾分別獲得2006年和2009年的諾貝爾化學獎。而剪接體是一個巨大而又復雜的動態分子機器，其結構解析的難度被普遍認為高于RNA聚合酶和核糖體，是世界結構生物學公認的兩大難題之一。

　　施一公告訴《賽先生》：“我們的工作揭示了基因剪接的結構基礎，可以把大部分生化數據連在一起，能夠很好地解釋過去的數據，也可以預測將來的實驗結果，但未來還要繼續推進這一項基礎研究工作，得到一系列的結構之后才能把中心法則的基因剪接全過程描述清楚。”

　　從施一公研究組發表的這兩篇論文可以看出，他們解析的基因剪接體是好幾個主要剪接體的共有結構。施一公表示，下一步的工作重點是把不同剪接體相互間不同的地方看清楚，從而闡述內含子被去除，外顯子被接在一起的分子機制。

　　首次在近原子層面得到細節

　　一直以來，對剪接體的結構解析是分子生物學里最熱門的研究之一。其中最有力的競爭者是劍橋大學分子生物學實驗室的日裔學者Kiyoshi Nagai博士，此前該領域近一半的工作都與他有關。而他所在的實驗室也是現代結構生物學和分子生物學的奠基之處，這里曾走出14名諾貝爾獎得主。

　　6月24日，Nagai研究組的一篇論文于《自然》網站在線發表，其工作將剪接體所涉及的一個中心復合物tri-snRNP的分辨率提高到了5.9個埃米，一度引起轟動。而此前人類對基因剪接體的認識精度只有29個埃米。1埃米為10-10米，即把1米分成十億份，其之微小可以想見，因此Nagai的最新工作被稱為近原子尺度的結構研究。

　　而施一公團隊此次得到的結果不僅將精度由5.9個埃米提高到了3.6個埃米，而且其解析對象是真正的剪接體，而不是Nagai團隊所取得的參與剪接體組裝過程的復合物，從而第一次在近原子分辨率上看到了剪接體的細節。

　　在施一公獲得的酵母剪接體高分辨率的三維結構中可以看出，剪接體的外形輪廓十分不對稱，各個蛋白相互纏繞，形成了分子量和體積巨大的復合物（如下圖）。

施一公團隊獲得的剪接體高分辨率的三維結構

　　同行評議：將受諾獎考慮

　　美國加州大學圣地亞哥分校(UCSD)的細胞與分子醫學系教授付向東在幾個月前已得知施一公得到的這一不平凡的結果，他今日通過郵件告訴《賽先生》：“我認為這是生物界的一件大事，因為世界上有多個頂尖的實驗室一直在努力攻克這一難題。這一工作是施教授一生中最杰出的貢獻，也是中國科學家近幾十年來對科學的最重大的貢獻之一。”

　　著名癌癥生物學家、美國杜克大學藥理學院講席教授王小凡也對《賽先生》表示：“施一公是蛋白質領域的世界頂尖科學家，他曾在這一領域做出過許多重要貢獻，而如今的這一最新發現，是施一公所取得的所有成就中最重要的。”

　　對整個生物學領域而言，王小凡說：“我相信這一發現將作為生物學中最重要的成就之一而彰顯于世（stand out），因為它解決了無數科學家都向往的生物學的基礎問題。”

　　王小凡還說：“考慮到諾獎已在有關RNA的結構問題上頒出兩次獎勵，我個人相信，施一公取得的這項成就將得到諾貝爾獎委員會的認真考慮（serious consideration）。這也是過去二三十年中，中國科學家在基礎生物學領域做出的最杰出成就。”

　　幸運之神何以垂青

　　這樣一個全球競爭的熱門領域，施一公何以能夠大幅領先國際優秀同行呢？

　　一直以來，研究蛋白質結構有三種主要方法：X射線晶體衍射、核磁共振以及單顆粒冷凍電子顯微鏡（冷凍電鏡）。而施一公所采用的冷凍電鏡技術在過去兩年里取得了革命性的進展，一方面是它的照相機技術，一方面是其軟件分析的圖像處理技術，尤其是前者的進步大幅提高了冷凍電鏡的解析能力。

　　施一公說：“如果沒有冷凍電鏡技術，就完全不可能得到剪接體近原子水平的分辨率。”

　　尤為幸運的是，早在冷凍電鏡技術還遠未成勢的2007年，清華大學就在上述三種方法中選擇了重點發展冷凍電鏡技術，如今清華擁有世界最大的冷凍電鏡系統。施一公把他和同事們當年卓有遠見的選擇歸于“幸運”，他說“如果沒有冷凍電鏡肯定做不到今天的結果，而當年確實沒想到冷凍電鏡會出現飛躍性的進展。”

　　“幸運”遠不止是當年選對了技術。除了儀器的進步，在施一公看來，他們能領先競爭對手的主要原因是擁有極為成熟的樣品處理方法。“也就是說如何讓蛋白質服服帖帖、性質穩定，成為適合結構解析的樣品”，他半開玩笑地說“這是我們的獨門絕招，這個絕招即便寫出來，別人不在我的實驗室做上一兩年也很難理解或吃透，因為這是師傅帶徒弟一點點積累起來的。”

　　除了靠譜的儀器、技術和學生，施一公說，“膽量”給了他們最大的驚喜。“本來我們的樣品不是最理想的狀態，學生有點不敢試，我說不妨上一下試試，最多就是不成功，只要有15埃的分辨率就很好了，結果算出來竟然有3.6埃。我們在今年整個4月份里做計算，那一個月突破連連、都跟做夢似的！”

　　“距應用還有很大距離”

　　長久以來，剪接體的結構解析一直被認為是最值得期待的結構生物學研究。因為許多人類疾病都可以歸咎于基因的錯誤剪接或針對剪接體的調控錯誤。據知人類35%的遺傳紊亂是由于基因突變導致單個基因的可變剪接引起的。還有一些疾病的起因是剪接體蛋白的突變影響了許多轉錄本的剪接。還有一些癌癥也與剪接因子的錯誤調控有關。

　　但盡管如此，施一公強調說：“這是一個基礎研究層面的發現，和應用差距甚遠。現在我們還不想談應用，這會誤導大家。”

　　在施一公看來，這次獲得的剪接體的高分辨三維結構和分子作用機制是一項生命科學基礎研究的重大突破，但基礎研究工作還未完成，需要進一步細化。即便基礎研究做完了，也與治療遺傳疾病的實際應用有很大距離。“因為不能說根據我們的剪接體結構就能直接發現引致疾病發生和治療的方法。這項工作的核心意義是讓人類對生命過程和機理有了更進一步的了解。”施一公說。