westernblot常見問題及解答

　　常見問題及解答：

　　1 、兩快玻璃板之間灌膠 , 膠為什么總是不平 ?

　　1)你的玻璃洗干凈沒有？應該要洗得非常干凈！

　　2)過硫酸銨和TEMED的加量不合適，加量相對較多，凝膠凝固過快也會膠不平，最多按照分子克隆加倍

　　3)加完試劑以后沒有很好的搖勻，導致有些部位的聚合劑濃度過高，聚合相對較快造成膠不平；

　　4)稍微注意手法，均勻加入

　　5)灌膠后應該用水或者正丁醇壓膠面或用20%的乙醇封頂(沒有毒性可以除氣泡，使用效果極好）。

　　6)邊緣膠是不容易聚合完全的，灌完膠后要立即加無水正丁醇覆蓋，濃度越低的膠越不要使用雙蒸水壓頂，另外還可以在壓頂試劑如正丁醇中添加少許AP來增加邊緣膠的凝聚強度

　　7)溫度也是影響膠聚合的重要因素，我們有些同學為了讓膠更快的凝固而把膠放到50度的溫箱，由于受熱不均勻，造成膠聚合不均勻。

　　2、膠為什么總是漏？

　　1）每次電泳完后，洗凈玻璃、膠條和其它附件，下次用之前，用75％酒精擦拭玻璃和膠條，能有效防漏，且利于剝膠。

　　2）避免玻璃邊緣（與膠條接觸處）破損很重要，尤其是下面和膠條接觸的地方

　　3）關鍵是找一塊很平的桌面，使兩塊玻璃底面非常齊就行了

　　4）膠條一定要干，跑完電泳后，膠條就放在實驗臺上晾著。

　　5）下面的膠條注意不要老化，如果有裂紋的話用保鮮膜墊在上面，也可以有效防止漏膠，或者反過來用。

　　6）玻璃在使用過程中容易造成小的缺口，從而導致封條無法完全密封，裝好架子后，在玻璃底邊上抹上一層薄薄的凡士林就好了，兩邊多點（容易從兩邊漏）這樣就不會漏了，就算是用了很久的很多小缺口的玻璃都沒有問題，然后轉移到電泳槽的時候，去掉封條，把底上的凡士林擦干就OK了。

　　7）你可以在海綿墊下再墊一些紙，使得它與玻璃貼的更緊密。或者在玻璃底部用瓊脂糖封上。

　　8）因為兩塊玻板沒有放的完全對齊，底部不在同一個平面，所以封條封不嚴，重新對齊后就不漏了。以后每次只要在水平的桌面上仔細對齊兩塊玻板，再夾緊。用手感覺一下確定在同一平面上后，放到灌膠架并壓在封條上，卡緊。注意兩邊均勻用力，一般不會再漏。

　　9）先把兩塊玻片放在夾子上，不要加緊，放到架子上，使兩塊玻片的底部對齊，夾緊兩塊玻片，然后取下再在其下面墊上墊片，這樣一般就不會漏膠了。但是如果你放了墊片再對齊玻片底部，或者在桌子上對其玻片底部然后放到架子上的話，經常會漏膠

　　3、條帶跑得比正常的窄？

　　1）可能因為膠凝的不均勻，聚合的不是很好，灌膠的時候盡量混勻

　　2）是不是有窄有寬？可能與你拔梳子的時候有關，拔梳應該迅速，沖洗加樣孔的時候要小心，以免把上樣帶扭曲；膠配好了用槍吹幾下再灌膠，還有就是要等指示劑跑到兩層膠交界成一線時，再調高電壓。

　　3）可能是你樣品的問題，如果鹽濃度較高，便會擠壓其它條帶，致使條帶寬窄不一，由于同樣的原因，樣品在凝膠中的速度會很慢，造成條帶走的較慢，好像與你的預想不一致

　　4）常見的原因是：每孔上樣量不均勻，應確保每孔中上樣量一致

　　5）可能是系統的ph出了問題，有可能是你的電極緩沖液，也有可能是凝膠緩沖液，更新緩沖液看看，看是否能成功。

　　4、為什么會有“微笑”和“倒微笑”這樣的效果呢？

　　1）"微笑"是因為你灌膠的時候冷卻不均勻，中間部分冷卻不好，導致凝膠中的分子有不同的遷移率所致。這種情況在較厚的凝膠以及垂直電泳時常常發生。“倒微笑”也稱“皺眉”現象常常是由于垂直電泳時電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當凝膠和玻璃板組成的三明治底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全便會產生這種現象

　　2）書上說出現“微笑”是因為整個膠冷凝的不均勻，中間部分和兩端受熱不一樣而致成了“倒微笑”可能是因為兩端的膠凝的不好，加APS和TEMED后應該混合均勻。

　　3）樣品中鹽濃度過高？點樣量太多或每孔點樣量不均勻？電泳電壓不穩定或過高？

　　5、Western-blot制膠時好多泡泡怎么辦？

　　1）首先，玻璃板一定要洗干凈，用洗潔凈洗，沖干凈后再用雙蒸水沖一，晾干。配膠的時候沿管壁緩緩加入各個成分，混勻的時候用手輕輕搖勻，如果用槍吹打時要緩慢且不要打到頭。

　　2）配膠時混勻要輕，盡量不產生氣泡，上膠時要快，槍也不打到底。加完分離膠后用雙蒸水封，待其凝固。即使在上膠時液面上有氣泡，加水后也會浮上來。分離膠凝好后，倒掉里面的水，用吸水紙吸干，再加濃縮膠，迅速插梳子。

　　3）倒膠的時候，用1ml的槍沿一側緩緩加入，不要打到頭，以免帶入氣泡！

　　4）將膠在小燒杯里配好后，將電泳槽略微傾斜，將燒杯的嘴靠在玻璃邊緣，直接倒進去，速度快，而且不容易產生氣泡，不妨試試

　　5）用雙蒸水封時建議用200ul的槍加水，這樣壓力小，以免把膠沖起來！

　　6）國產的只能是緩慢加樣，別把氣泡加進去。如果加進去了，小心把整個板在桌上敲敲可以讓氣泡浮上來。

　　7）分離膠中的氣泡與插梳子有關，垂直插容易產生氣泡，且不容意排除。將梳子傾斜5-10度插入，即使產生氣泡也可以也可以通過輕輕晃動梳子使氣泡從一側逸出。

　　8)pinghw還有一個制膠起泡泡的原因，就是配膠的液體全部在四度存放，室溫制膠時由于溫差及凝膠聚合反應放熱的關系，液體中微小的氣泡在凝固的凝膠中也會放大成可見的較大的泡泡，這種情況在夏天室溫較高時更容易出現。避免的方法是將制膠成分中除催化劑外的部分配置后放室溫下靜置一會兒，減小溫差后再加入催化劑制膠。