| 實驗步驟 | 一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
稀釋緩沖液（20 mmol/L HEPES>HCl、pH8.3，50 mmol/LNaCl,0.2 mmol/L EDTA)
4X 雜交緩沖儲存液：4mol/L NaCl,200 mmol/L HEPES、pH8.3,4 mmol/L 十六烷
基三乙基溴化銨（CTAB)。最終的 1X 雜交緩沖液，用稀釋緩沖液稀釋。
礦物油
2. 核酸和寡核苷酸
連接 Ad1 的檢測者 1-1(方案 1 第 4 階段第 8 步）
連接 Ad2R 的檢測者 1-2(方案 1 第 4 階段第 8 步）
驅動 DNA(方案 1 第 3 階段第 5 步）
Rsa I 消化的驅動 DNA(方案 1 第 3 階段第 5 步）
3. 專用設備
兩臺熱循環儀（見第 11 步和第 12 步）
二、方法
1. 第一次雜交
（1）按照下面的順序，將每個檢測者樣品與試劑混合。
（2）用 1 滴礦物油覆蓋樣品，并短暫離心。
（3）將樣品在熱循環儀中 98°C 溫育 1.5 min。
（4）根據樣品類型，按照下面列出的時間將樣品在 68°C 溫育，然后立即進入第二次雜交。
本方案使用 15ng 連接的檢測 DNA 和 450ng 驅動 DNAa 如果得要不同的消減效率，可以改變驅動者和
檢測者的比例。
2. 第二次雜交
（9）（原文無 5~8 步—譯者注）對每個實驗的驅動 DNA, 重復下面步驟。
將下面的試劑，加至滅菌的 0.5 ml(原文為 1ul。一譯者改）離心管中。
（10）從混合物中取 1ul, 加至 0.5 ml 離心管中，并加 1 滴礦物油覆蓋。
（11）在熱循環儀中 98°C 溫育 1.5 min。
（12）將剛剛變性的驅動者離心管取出，立即放入另一臺已穩定在 68°C 的熱循環儀中。
使用另一臺熱循環儀（或另一個 block) 可以確保樣品的迅速降溫。
（13）然后，按照同樣的順序，依次加入已雜交的樣品 1-1 和 1-2(來自第一次雜交）。
這樣確保在剛變性的驅動 DNA 過董的情況下，兩個雜交樣品漫合。
（14）將雜交反應液在 68°C 溫育過夜。
（15）加入 100ul 稀釋緩沖液，并吹吸混勻。
（16）在熱循環儀中 72°C 溫育 7 min。
（17）在-20°C 保存雜交反應液。 |
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