下一代分子診斷技術

自動化的高通量測序系統已經對生命科學研究產生了不可磨滅的影響。它們現在正準備革新分子診斷技術。

CRISPR和下一代測序技術正在革新從傳染病到早期癌癥檢測的分子診斷，這門科學可能引領什么？

CRISPR基因編輯和下一代測序（next-generation sequencing, NGS）技術已經革新了臨床和生命科學研究模式。CRISPR允許對特定的核苷酸序列進行有選擇的靶向和編輯，其精確度和易操作程度在幾年前是無法實現的。NGS可以實現高通量、精確且可負擔的DNA或RNA測序。

這些技術共同促進了基礎分子和細胞生物學以及疾病研究的眾多進展，CRISPR的發現甚至為其背后的研究人員贏得了2020年的諾貝爾獎。它們也在幫助開發新的基因和癌癥療法，如CAR-T細胞。

雖然這些成就被廣泛認可，但CRISPR和NGS對分子診斷的影響也可能同樣深遠。一些基于CRISPR和NGS的診斷方法已經進入臨床，但正在開發的應用數量要多得多。這些診斷方法可以實現早期疾病檢測、準確的疾病監測以及在眾多領域的精準治療中更靈活的管理。

正如早期的免疫吸附測定或熒光原位雜交一樣，CRISPR和NGS為開發分子診斷的人提供了重要的機會。這門科學處于什么位置，它可能引領什么？

CRISPR作為一種診斷手段

2016年，美洲的寨卡（Zika）病毒爆發為第一個獲批的CRISPR診斷創造了條件。此后，CRISPR診斷法被用于檢測拉薩（Lassa）和埃博拉（Ebola）病毒，以及SARS-CoV-2。迄今為止，傳染病的爆發推動了技術的發展。但任何需要對已知基因靶點有高選擇性的環境，如腫瘤樣本的分析、遺傳性基因變體的鑒定或無創產前檢測（non-invasive prenatal testing, NIPT），都可能是CRISPR診斷的候選對象。

CRISPR是最著名的基因編輯系統，其中Cas9蛋白經過設計與向導RNA配對，然后與靶DNA互補結合。當靶DNA被識別后，Cas9會在一個確定的位置剪切序列，允許基因刪除或插入。

基于CRISPR的診斷背后的機制與基因編輯相似，因為它使用了一種經過設計的向導RNA。但它通常采用不同的Cas蛋白，即Cas 12、Cas 13和Cas 14。這些蛋白質可以被修飾，以便在靶核苷酸序列（DNA或RNA）存在的情況下產生熒光信號，使該系統適用于檢測或成像。

雖然大多數研究人員都在開發他們自己的CRISPR診斷方法，但最近出現了兩個商業平臺來加速這一過程。SHERLOCK是由博得研究所（Broad Institute）的Feng Zhang小組開發的。而DETECTR則是由Jennifer Doudna與她在加州大學（University of California）伯克利分校的團隊一起創建的（Doudna因發現CRISPR-Cas9而獲得諾貝爾獎）。這兩個平臺都使用CRISPR提供快速體外鑒定靶序列的atto摩爾級別的靈敏度。

與任何分子診斷相同，CRISPR測試需要足夠的靶DNA用于檢測。因此，它們通常在檢測之前依賴一個擴增步驟。這通常是通過聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）來完成的，聚合酶鏈反應是一種需要熱循環儀擴增核苷酸序列的高保真方法。與真正的基于PCR的診斷方法不同，例如逆轉錄酶PCR（reverse transcriptase PCR, RT-PCR），CRISPR診斷也可以使用其它擴增方法，這是一個優勢。

賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）的基因組編輯產品經理Matthew Poling表示，當開始考慮在臨床醫生的辦公室或現場進行此操作時，他們沒有熱循環儀。為了使對于這些診斷方法進入以患者為中心的即時護理工作，LAMP正變得更有前景。

LAMP或稱環介導的等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification）是一種新興技術，可在恒定溫度下擴增核苷酸序列。與PCR中用熱分離雙鏈DNA不同，LAMP需要一種DNA聚合酶（DNA polymerase），如EquiPhi29或BSM DNA聚合酶，來主動“解旋”和擴增雙鏈DNA。該技術也可用于檢測RNA序列。

除了CRISPR試劑，賽默飛世爾科技公司還提供各種LAMP聚合酶作為凍干兼容的酶。這些可凍干的酶不含甘油，在運輸和儲存時保持穩定，使它們更適合在現場或在醫療點使用。

使用CRISPR技術診斷癌癥

腫瘤學是最大的一個可能受益于CRISPR診斷的臨床領域。雖然現在還不可能走進醫生的辦公室并要求進行CRISPR測試，但研究人員正在進行這項工作。在一個原理驗證的實驗室中，科學家們使用SHERLOCK平臺來檢測已知的癌癥突變。其他研究者正在采取不同的方法。

Harveer Dev是英國癌癥研究中心劍橋中心（Cancer Research UK Cambridge Centre）早期檢測項目（Early Detection Programme）的臨床講師和組長，目前正致力于分析和識別前列腺癌的普遍生物標志物。他正在開發一個名為ProCASP的基于CRISPR的平臺，該平臺可以繪制個體腫瘤的遺傳變異，以幫助預測其對某些藥物的敏感性。

Dev表示，其目的是繪制個體患者的腫瘤內特定基因的功能圖譜。他希望他的工作最終能轉化為一種診斷，為病人的治療計劃提供參考。

如果還有另外一層信息可以補充，Dev認為這對于打造不同患者所接受的特定治療將非常重要。

在癌癥和其它疾病中，CRISPR診斷仍然面臨挑戰。例如，當前的CRISPR診斷還不能在高通量環境中使用。此外，所有基于CRISPR的診斷平臺都需要一個單一的已知靶序列，這在某些癌癥和其它多因素遺傳性疾病中可能尤其具有挑戰性。在CRISPR工具能夠同時應用于多個基因之前，需要這種復用類型的診斷可能更適合下一代測序工具。

診斷學中的下一代測序技術

與CRISPR相同，下一代測序技術已經從一個標準的研究應用迅速推進到一個復雜的診斷工具。

立陶宛維爾紐斯賽默飛世爾科技公司的研發經理?ana Kapustina表示，當NGS變得可負擔時，它實現了無假設實驗，研究者并不需要知道他們在尋找什么。

如今，快速平行測序使研究人員能夠尋找未知的基因變異，如檢測罕見的疾病，或一次性篩選出一組可能的基因變異。該方法已成為腫瘤學的基礎，即開發液體活檢或精準療法的輔助診斷，并且它正在研究應用于遺傳性聽力和視力損失、遺傳性心肌病和常染色體顯性多囊腎等疾病的診斷。NGS還能實現單細胞測序，這使得可以在單個細胞水平上發現生物標志物。

在這一點上，NGS技術已經很成熟了，但研究人員仍然面臨著一些持續的挑戰。其中之一是文庫制備。在任何NGS篩選中，研究人員首先將樣本DNA分割成小片段，并對其進行標記以方便識別。然后對這些片段進行測序，并對結果進行分析。這可能是一個耗時的過程。

Kapustina表示，不幸的是，他們不能跳過文庫的準備工作，但他們正在努力使這些工作流程盡可能地簡潔和方便。賽默飛世爾提供了一系列標準化試劑，支持Ion Torrent和Illumina測序儀的文庫制備，同時還為開發特定診斷的研究者提供專家指導服務。

研究人員的另一個挑戰是樣品的穩定性。賽默飛在維爾紐斯的產品經理Sigita ?in?iūt?表示，這對使用液體處理機或機器人系統的人來說非常重要，因為他們[加入他們的樣品并]將其放置一段時間，甚至幾天。賽默飛積極與研究人員協商，幫助他們建立考慮到這些因素的工作流程和診斷方法。

擴展診斷工具箱

適用于分子診斷的技術并不是很常見。分子診斷市場仍由數十年的PCR和ELISA檢測所主導。CRISPR和NGS診斷程序的發展為擴展這一組合提供了難得的機會。

事實證明，這兩種技術都很容易適應和擴展，允許快速開發和測試候選診斷，而且它們都相對成本低，使它們對保險公司和衛生系統更容易接受。它們還能相互補充，NGS可用于識別未知變異或同時篩查幾個已知的生物標志物，而單細胞測序CRISPR診斷很適合在現場或醫療點使用。

CRISPR和NGS診斷不太可能取代更成熟的方法。相反，幾乎可以肯定的是，它們將擴大目前無法獲得的不同類型的診斷信息。就Dev而言，他已經在使用多種工具來診斷前列腺癌。

Dev表示，無論最終依靠什么診斷工具，它都將是多模式的，這些工具不可能孤立地存在。

這對那些追求分子診斷的人來說是個好消息，或者對CRISPR和NGS在農業或生物燃料領域更遠的應用發展來說是個好消息。但最重要的是，這對患者來說是個好消息。