新一代單細胞itChIP技術解析早期胚胎細胞命運決定機制

　　2019年9月3日，北京大學分子醫學研究所、北大-清華生命科學聯合中心何愛彬組在《Nature Cell Biology》在線發表了題為Profiling chromatin state by single-cell itChIP-seq的文章，報道了利用一種全新的普適性，易操作的單細胞ChIP-seq技術解析早期胚層和器官發育中細胞命運的選擇決定機制，并將這一方法命名為itChIP（simultaneous indexing and tagmentation-based ChIP-seq）。該工作首次解析了小鼠胚胎干細胞退出全能性，向三個胚層分化過程中的表觀調控時空規律。同時，通過整合單細胞轉錄組和單細胞ChIP-seq數據，研究者揭示了心臟干細胞向心肌和內皮細胞分化過程中細胞類型特異性增強子對細胞命運決定的調控機制。

　　多細胞生物體由具有相同基因組的不同細胞類型組成，在器官組織發育過程中，細胞狀態和細胞命運決定的機制一直是領域普遍關心的問題。 無論在發育過程還是疾病狀態下，表觀遺傳因素（不改變DNA序列的情況下）在細胞命運決定中起著指導性作用。細胞類型和功能異質性往往通過調控基因表達來實現。目前研究多集中在單細胞轉錄組水平，單細胞水平解析表觀調控機制也鮮有報道，而從單細胞、全基因組范圍研究組蛋白修飾和轉錄因子如何控制細胞譜系發生、命運決定則尚屬空缺。

　　研究這一問題，需要在單細胞水平解析全基因組范圍內DNA-蛋白質的相互作用圖譜，染色質免疫共沉淀（ChIP-seq）技術是捕獲蛋白質-DNA相互作用的有效手段，然而目前單細胞ChIP-seq技術仍面臨諸多挑戰，極大限制了人們對細胞命運特化的調控機制的認識。為了解決這一技術難題，何愛彬課題組利用Tn5轉座酶切割DNA，切割完的DNA直接帶上可供PCR擴增的DNA序列。巧妙之處在于，研究人員用甲醛交聯樣品，然后在高溫下用SDS處理細胞，這樣能使全基因組染色體變得松散，同時不會影響蛋白質與DNA的結合。在這種處理下，Tn5能均勻地切割染色體并提高抗體結合效率，而且不會產生對開放區域的偏好性。采用單細胞itChIP-seq技術，研究人員成功捕獲了100，500以及10,000個細胞多種組蛋白修飾以及DNA-結合蛋白在基因組的結合圖譜。通過單細胞itChIP對近2,000個上胚層樣細胞（epiblast-like cells, EpiLCs）的H3K27ac（標記激活型增強子的組蛋白修飾）的信號進行分析，研究者揭示在發育過程中，外胚層和內胚層的命運可能提前決定（尚未觀察到基因表達或者表型出現），而中胚層分化最后發生。為了進一步證明單細胞itChIP適用于細胞數量很少的珍貴胚胎組織樣品，研究人員對胚胎期第7.75和第8.25的NKX2-5譜系的心臟細胞同時進行了單細胞的RNA-seq和單細胞H3K27ac itChIP實驗。通過對這兩個不同維度的單細胞數據進行整合分析，研究人員發現了在心臟干細胞向心肌細胞和內皮細胞兩個不同譜系分化過程中，增強子表現出譜系特異性的激活和關閉。雖然基因表達呈現出平滑的逐漸上調和下調（線性變化）的漸變趨勢，但是增強子卻表現出驟變式（指數級變化）的激活或者失活，這一現象說明增強子比其調控的基因表現出更強的時空特異性。因此，單細胞itChIP不僅適用于上千個單細胞的捕獲，同時也可用于捕獲起始量只有幾十個單細胞的樣品，這為研究稀少細胞樣品例如植入前胚胎等的表觀調控異質性提供了新的技術手段。

　　北京大學分子醫學研究所博士生艾珊珊和北大-清華生命科學聯合中心博士生熊海清為論文共同第一作者，何愛彬研究員為本文的通訊作者。該研究獲得了科技部干細胞專項、國家自然科學基金委的和生命科學聯合中心的支持。