血液病的分子生物學檢查及其應用

血液分子生物學檢驗技術主要包括PCR技術、DNA測序技術、限制性片段長度多態性（RFLP）、轉基因技術及基因芯片（DNA-chip）技術等分子生物學技術。目前，這些技術在血液學檢驗領域已得到廣泛應用，如應用于血液病基因分析、基因診斷、白血病分型、指導治療、判斷預后和微小殘留病檢測等方面。隨著分子生物學技術的進一步發展，血液病的基因表達和治療、細胞之間和細胞內的信號傳導、特異的血液病基因或融合基因的檢測及應用將成為當代血液分子生物學檢驗的主要內容和方向。本節將介紹幾種常用的血液分子生物學技術。

一、核酸分子雜交技術

(—)Southern印跡雜交
Southern印跡雜交（Southern blot hybridization）是一種常用的分析DNA結構的核酸分子雜交技術。其原理是將待測的基因組DNA經限制性核酸內切酶消化后，瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，凝膠經堿處理使DNA變性，再將其從凝膠中印跡到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，以放射性或非放射性標記的DNA探針與固相支持體上的DNA雜交，根據探針的標記特性用相應方法顯示雜交條帶，對待測DNA進行分析。

(二)Northern印跡雜交
Northerm印跡雜交（Northern blot hybridization）和Southern印跡雜交的過程基本相同，區別在于靶核酸是RNA而不是DNA。待測RNA經變性及瓊脂糖電泳分離后，按大小不同而相互分開，隨后將其轉移至硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然后用DNA或RNA探針雜交，按探針的標記特性對雜交信號進行檢測，對待測RNA進行分析。

（三）核酸原位雜交
以放射性或非放射性標記的DNA或RNA探針在組織、細胞及染色體上與其相關的核酸序列雜交，簡稱原位雜交(in situ hybridization)。原位雜交的原理是應用核酸探針與組織或細胞中的核酸按堿基配對原則進行特異性結合形成雜交體，然后應用組織化學或免疫組織化學方法，在顯微鏡下進行細胞內定位或基因表達的檢測技術。此項技術是在保持細胞，甚至單個染色體形態的情況下完成的，因此通常用于檢測染色體的異常改變、腫瘤致病基因和腫瘤微小殘留病的檢測等。

二、聚合酶鏈反應

聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)技術于1985年由美國Mullis等建立。PCR技術使體外擴增核酸片段成為可能，使人們能夠在幾小時內從試管中獲得大量特異核酸片段。由于核酸是生物體儲存和傳遞遺傳信息的載體，因此能夠迅速獲得大量特異核酸片段的PCR技術給生命科學各個領域的研究手段帶來了革命性的變化。該技術已經與DNA克隆、DNA重組和DNA測序等技術一樣成為血液分子生物學一項不可缺少的工具。PCR技術的重要性在于能在體外快速、高效地從復雜DNA中特異地擴增目標DNA。其主要優點是：①快速簡便，設備要求低，一般擴增幾小時即可完成。②高度敏感，樣本量極小，甚至能用單個細胞進行基因分析，大大提高了基因診斷的靈敏度和準確性。③樣品適應范圍廣。④PCR產物的分析主要采用凝膠電泳的方法，大大推動了非放射性基因診斷技術的發展，便于推廣。

（一）PCR技術的原理和反應過程
PCR是一種在試管中進行的DNA復制反應，基本原理與細胞內DNA的復制相似。是一種模擬天然DNA合成過程的選擇性體外擴增方法。每一次復制反應分三個步驟即：①變性（denatoration）：在加熱條件下，DNA變性，螺旋解開。②退火(annealling)：在退火條件下，引物與模板DNA結合。③延伸(extension)：在耐熱DNA聚合酶(Taq DNA polymerase)4種脫氧核糖核苷三磷酸底物(dNTP)、鎂離子及合適PH值的緩沖液條件下，聚合酶催化以引物為起始點的5’→3’DNA鏈延伸反應，把基因拷貝數由2個增至4個。在反應的初期原來的DNA擔負著起始模扳的作用，隨著循環數的遞增，由引物介導延伸的片段急劇地增多而成為主要模板。重復上述過程25~30個循環，就可把基因拷貝數以指數形式增加至上百萬倍，從而達到體外擴增核酸序列的目的。

（二）PCR反應的基本條件及循環參數
1．PCR反應的基本條件
（1）模板 模板就是將要被復制的核酸片段，包括基因組DNA、RNA、質粒DNA和線粒體DNA等。 傳統方法提取制備的DNA樣本均可直接用于PCR，如基因組DNA、cDNA，若起始材料是RNA，先通過逆轉錄得到第一條cDNA，再進行擴增，即所謂的逆轉錄PCR(RT-PCR)。也可用細胞變性提取液直接進行擴增以及用陳舊血斑提取DNA用于擴增。但不管標本來源如何，模板都需純化，使其不含蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑以及能結合DNA的蛋白質等。
（2）引物  引物是決定PCR結果的關鍵，其決定PCR擴增產物的特異性和長度。引物的合成一般是在已知序列的DNA某個區的上、下游合成兩個與其兩股鏈3’端互補的寡核苷酸，一般長度為15~30bp，G+C含量約50％。應盡量避免數個嘌嶺或嘧啶的連續排列，避免引物內部形成二級結構。兩個引物之間不應發生互補，特別是在引物3’端，避免形成“引物二聚體”。引物濃度不宜過高，否則易形成引物二聚體，或者是容易產生非特異性產物。目前引物大多已商品化。
（3）dNTP  即dATP、dCTP、dGTP和dTI'P。高濃度dNTP易產生錯誤摻入，而濃度過低又會降低反應的產量。通常用20~200μmol/LdNTP，不能低于10~15μmol/L。4種三磷酸脫氧核苷的濃度必須一致，四種核苷酸間濃度的不平衡會增加反應時DNA聚合酶錯配的機率。DNTP的PH值也很重要，一般應調至8.3~8.6。
（4）Taq DNA聚合酶  Taq DNA聚合酶在70~75℃時具有最高的生物學活性。在92.5℃、95℃、97.5℃下，酶的生物半衰期分別為130min、40min和5~6min。在PCR反應中，變性溫度一般為94℃，30s，最長不超過60s，以循環30次計算，Taq DNA聚合酶可保證PCR反應的需要。Taq DNA聚合酶是Mg2+依賴性酶，酶的活性對Mg2+濃度非常敏感，合適的KCl濃度和dNTP用量，有利于酶活性的發揮。酶的用量根據擴增片段的長短及其復雜程度(G+C含量)不同而有所區別。
（5）擴增緩沖液  標準緩沖液中，KCl用量為50mmol/L、Tris-HCl用量為10 mmol/L，在緩沖液中加入Taq DNA聚合酶穩定劑如小牛血清白蛋白、明膠、Tween20等，有助于穩定聚合酶。
（6）Mg2+　 Mg2+濃度對反應產物的特異性及產量有顯著影響。濃度過高使反應特異性降低；使反應產物減少。在各種單核苷酸濃度為200μmol/L時，Mg2+濃度為1.5 mmol/L較合適。
2．PCR循環參數
（1）變性溫度和變性時間  解鏈不完全是導致PCR失敗的一個主要原因。一般來說，94℃ 1min可使起始模板完全變性。
（2）退火溫度與退火時間  退火溫度與時間應隨所用引物的Tm值及擴增片段的長短而調整。一般說來，退火溫度比引物的Tm低5℃，退火時間不能少于30s，但也不能太長，否則會引起非特異性退火。Tm=4(G+C)+2(A+T)，此公式僅適用于14~20個堿基的人工合成引物。
（3）延伸溫度與時間  引物延伸溫度一般在72℃左右，延伸時間應根據擴增片段的長短來調節。正常情況下，每分鐘可延伸1kb的長度。
（4）循環數  在其他參數已優化的條件下，最適循環數取決于靶序列的初始濃度。事實上擴增產物的指數累積并不是無限制的。隨著循環數的增加，引物和dNTP大量消耗，酶的活性也下降，退火時模扳互補鏈之間的復性也逐漸增加，擴增效益下降，擴增產物從指數形式增長逐漸恢復為線性形式增長。一般取20~30個循環數。

（三）PCR產物分析
PCR產物檢測方式有多種，常用的有凝膠電泳法、斑點雜交法、Southern印跡雜交法、原位雜交法、顏色互補分析法及PCR-ELISA法等。
1．瓊脂糖凝膠電泳  是一種簡便易行的分離DNA片段的方法。在PH值8.0時，DNA分子帶負電荷，在電場中向陽極移動，其移動速率同分子大小成反比，分子越大，在凝膠孔中受到的阻力越大，相反分子越小，在凝膠中移動越快。待分離的PCR產物中要加入溴化乙錠，在紫外燈下觀察電泳條帶時，溴化乙錠與DNA結合，發出棕紅色的熒光。
2．Southern印跡雜交  是基因診斷常用技術之一。將瓊脂糖凝膠電泳分離的PCR產物在原位變性，并將變性產物轉移到硝酸纖維素膜或尼龍膜上，然后用生物素等標記的探針檢測該產物。
3．斑點雜交法  當擴增產物是多條帶紋時，可用斑點雜交法分析PCR產物。首先將擴增的片段固定在硝酸纖維素膜或尼龍膜上，用生物素等標記的探針雜交。或將不同的探針固定在同一尼龍膜上，用標記的PCR產物作探針雜交，根據雜交點的位置即可判斷產物序列變異的種類。斑點雜交有助于檢測突變DNA的突變類型，有助于遺傳病的基因診斷，還可用于基因多態性分析，如HLA基因多態性分析。
4．PCR-ELISA法  待測PCR產物需攜帶有生物素等固定集團和地高辛等檢測集團。PCR反應產物中帶生物素標記的引物延伸鏈與帶地高辛標記引物延伸鏈形成雙鏈，生物素等固定集團可與微孔板上包被的親和素結合，向微孔板中加入酶標記地高辛抗體和生色底物，即可對PCR產物進行ELISA檢測。
5．原位雜交法  PCR產物也可用原位雜交法檢測，所用探針可用生物素、地高辛或熒光標記。

三、以PCR為基礎的其它相關技術
近年來PCR技術在應用的過程中得到了進一步的發展。目前已出現多種以PCR為基礎的PCR相關技術，形成了適用于不同目的的PCR技術系列，以下是幾種在血液學及檢驗領域應用較多的PCR相關技術。

（一）逆轉錄PCR
逆轉錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）是以細胞內總RNA或mRNA為材料進行的體外擴增技術。由于耐熱的DNA聚合酶不能以RNA或mRNA作為模板，因此必須先將總RNA或mRNA作逆轉錄，生成與之互補的cDNA，然后再以cDNA作為模板進行PCR擴增，得到所需要的目的基因片段。RT-PCR常用于克隆cDNA、合成cDNA探針以及分析基因表達等。

（二）定量PCR
最初的PCR技術只是用于定性檢測DNA或RNA，對PCR產物的數量并不重視。隨著科學研究的逐步深入，人們開始考慮用PCR技術來進行DNA或RNA的定量檢測，隨之出現了定量PCR（quantitative PCR，Q-PCR）技術這一新名詞。目前常用的Q-PCR技術可分為終點法和實時法。
1．終點法Q-PCR  所謂終點法Q-PCR是指在PCR結束以后根據最終的PCR產物量來決定模板中目的基因的數量。而根據所用內對照的區別，終點法Q-PCR又可以分為兩種。
（1）使用管家基因進行相對定量  在擴增目的基因的同時擴增管家基因（β-actin\GAPDH等），PCR反應結束后將產物通過瓊酯糖電泳和EB染色后用密度掃描分別得到各標本的目的基因和管家基因的產物量，最后得到各標本間目的基因數量校正值（目的基因數量/管家基因數量）的差別。此方法一般用于檢測一些在不同時相表達差別較大的基因，例如用藥前后某基因表達量的改變、某基因在不同組織的表達差異等。這些方法只能得到目的基因的相對定量值，其定量的準確性和精確度都較差，同時受人為因素的影響很大，所以目前已經被淘汰，只用于一些對精確度要求不高的簡單實驗。
（2）人為設計一種已定量的內參基因對目的基因進行定量分析  一般來說，設計的內參物具有以下特點：①擴增的片段大小和目的基因相似。②擴增的片段中GC含量與目的基因接近，引物的退火溫度和擴增目的基因的引物接近。③該內參物已經被精確定量。在進行PCR時，目的基因和內參基因同時擴增，這兩種基因在反應體系中存在競爭機制，所以最終目的基因的產物量與內參基因的產物量成反比關系。我們可以通過內參物的量來決定目的基因的量。現在也有研究者在體外構建目的基因的突變子，這樣一來可以和目的基因共用PCR引物，簡化了實驗方法。
由于最終的結果取決于密度掃描的精度，所以終點法Q- PCR分析技術的準確性受到限制，目前已被最新的熒光實時Q- PCR技術取代。
2．熒光實時FQ- PCR技術  近年來發明的熒光定量PCR儀使熒光定量PCR（fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR）技術達到了精確定量的要求。實時FQ- PCR引入特異的熒光探針技術，該探針與PCR引物對內側的一段序列同源。探針的5’端標有報告熒光（FAM、JOE），而在3’端標有淬滅熒光（TAMRA）。當探針保持完整時，報告熒光的發射波長被淬滅熒光的激發波長吸收，因此檢測不到報告熒光信號。當PCR進行過程中，TaqDNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性可以將熒光探針切成單個堿基，使報告熒光不再受淬滅的影響，使報告熒光的熒光信號可被檢測到，并隨著PCR循環圈數的增加而增加熒光信號。在實時定量PCR系統中，我們將檢測到的熒光信號強度（△RQ）超過基礎值10倍的循環圈數定義為循環閾值（cycle threshold，Ct）。因此當標本中模板拷貝數越多，則Ct越小，而模板拷貝數越少，則Ct越大，達到構建已知標本的目的。針對不同的融合基因，設計特異的熒光探針和引物，PCR擴增后計算校正拷貝數，陽性標本的拷貝數一般大于某一特定的設定值（多次實驗的經驗值），而陰性標本的拷貝數小于設定值。
Q- PCR除了可以進行融合基因的定性分析外，最重要的功能是通過監測患者融合基因拷貝數來判斷治療效果和預后情況，以及預報復發的可能。以急性早幼粒細胞白血病患者的定量分析結果為例，如果患者的融合基因拷貝數經過治療以后呈現持續下降的趨勢，則該患者的治療效果較佳，預后良好，可以獲得較長的無病生存期；而如果患者的融合基因拷貝數呈現較大的波動，甚至有上升的趨勢，則預示該患者的治療效果較差，有復發的可能性，需要進行強化治療以提高緩解率。

（三）多重PCR
多重PCR（multiplex PCR）即在同一反應體系中加入多對引物，以同時擴增一份DNA樣品中多個不同序列的靶片段。多對引物間的組合必須滿足二個條件，一是將反應條件較為接近的引物組合在一起，以使該反應條件能盡量適合所有被擴增片段，二是同一反應內各擴增片段的大小應不同，以便檢測時能通過電泳將各片段分離開。多重PCR比較適用于被檢測基因較大，突變點較多的基因。

（四）差異顯示PCR
差異顯示PCR（differential display PCR，DD-PCR）是一種以逆轉錄PCR為基礎的研究基因表達差異的技術。基因在不同組織細胞中的表達不同，在細胞的不同發育階段和狀態中的表達也有差異。研究基因表達譜的變化有助于理解細胞分化、增殖、細胞周期的調節和細胞衰老、凋亡的過程。

（五）原位PCR
原位PCR（in situ PCR）是指組織固定處理細胞內的DNA或RNA，并以其作為靶序列進行PCR反應的過程。原位PCR與普通PCR的主要區別在于模板的制備。經脫蠟處理的組織切片或細胞懸液均可作為擴增樣品，所有反應在載玻片上進行。原位PCR技術不僅不需要從組織細胞中分離模板DNA或RNA，而且能在細胞原位進行PCR擴增，大大地提高了檢測的靈敏度。目前，原位PCR已成為研究靶基因序列的細胞定位、組織分布和基因表達檢測的重要手段。

四、 基因芯片技術
基因芯片技術又稱DNA微陣列（DNA - chip）。該技術是二十一世紀生命科學領域廣泛應用的一項高效快速的分子生物學技術。DNA-chip是將大量以特定排列方式的基因探針或基因片段固定于硅片、玻片和塑料片上，樣品DNA或RNA通過PCR擴增，體外轉錄等技術摻入熒光標記分子，與微陣列雜交后再通過熒光掃描儀及計算機分析，即可獲得樣品大量基因序列及表達信息。目前，基因芯片技術主要應用于白血病的免疫分型、細胞的基因表達檢測、基因異常檢測及單核苷酸多態分析等。

五、分子生物學檢查在血液學中的應用
（一）惡性血液病融合基因的檢測  
白血病染色體相互易位是導致染色體重排的最常見原因。染色體重排在分子水平上常形成融合基因。重組產生的融合基因及其融合蛋白是疾病的特異性分子標志。融合基因檢測對疾病的診斷、分型、治療方案的選擇、預后判斷及微小殘留病的檢測都有重要的意義。
慢性粒細胞白血病(CML)Ph 染色體易位的后果是使位于9q34上的ABL原癌基因易位至22q11的BCR基因上，形成BCR-ABL融合基因，表達一個具有高酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白，后者是CML發病的分子基礎。應用傳統的Southern印跡雜交法，以BCR為探針，發現所有Ph陽性的CML均有該基因的重組，而多數Ph陰性的CML也有BCR-ABL基因的重組。由于PCR方法靈敏、快速，目前多采用逆轉錄PCR(RT-PCR)法來檢測CML的融合基因，即以待測mRNA BCR-ABL轉錄本為模板，用逆轉錄酶合成BCR-ABL接頭部順序的cDNA，設計擴增引物，經PCR擴增后檢測擴增產物。這樣只有有關染色體發生易位后才能擴增到產物。目前采用FISH法對染色體原位檢測BCR-ABL也是十分有效的。
急性早幼粒細胞白血病(APL)特異性染色體易位是t(15；17)(q22；q21)，易位的結果使15號染色體的PML原癌基因與17號染色體上的維甲酸受體a(RARa)基因融合產生PML-RARa融合基因，亦可通過Southern印跡雜交、RT-PCR及FISH法進行檢測。臨床上變異型APL（M3v，M3b）與急性粒細胞白血病部分分化型(M2)較難鑒別，M2的t(8；21)可產生一種融合基因AML1-ETO，這種融合基因在M2中的發生率為20％~40％，在M2b中可達90％，通過融合基因的檢測可準確鑒別這兩種白血病。M3患者有t(15；17)和PML-RARa融合基因者對反式維甲酸(ATRA)療效較好。也有少數患者無t(15；17)，而有PML-RARa融合。近年來，一些經細胞形態學、細胞化學、免疫組化檢測確認為M3的患者，對ATRA不敏感，細胞遺傳學檢查為t(11；17)或t(5；17)，經分子水平檢測分別為PLZF-RARa和NPM-RARa融合基因，或有更復雜的染色體易位。融合基因的檢測對治療方案的選擇有明確的指導作用，仍以M3為例，在ATRA和化療達完全緩解(CR)的M3，自體骨髓移植(ABMT)前PML-RARa融合基因陽性者極易在十個月內復發，而融合基因陰性者，復發率低。

（二）免疫球蛋白重鏈（IgH）基因和T細胞受體（TCR）基因重排的檢測
IgH和TCR的編碼基因具有多態性。IgH基因重排是產生個體多樣性和獨特性的主要原因。由于白血病細胞源于造血干細胞，所以白血病細胞是單克隆性的。用PCR方法對重排基因進行擴增，正常白細胞的擴增產物大小不等，呈模糊的階梯狀，而白血病細胞擴增產物經電泳后條帶是單一的。約80%的B淋巴細胞白血病可檢測到IgH基因重排。通過PCR方法檢測IgH和TCR基因重排，有助于急性淋巴細胞白血病的分型以及微量殘留的檢測。

（三） 遺傳性血液病的診斷　
血紅蛋白病是常見的遺傳性溶血性疾病，血友病是常見的遺傳性出血性疾病。基因缺陷包括基因缺失、點突變、插入、倒位等。對于基因重排，可通過RT-PCR進行檢測；對于點突變則可用PCR結合酶切位點分析，即當點突變使某一酶切位點消失或在某一區域出現新的酶切位點時，可用該酶切點兩側的引物進行擴增，然后將擴增產物用適當的內切酶切割，根據電泳圖譜來判斷有無內切酶切點的改變。對于與限制性內切酶點無連鎖的點突變，則可采用PCR結合特異寡核苷酸探針（ASO）斑點雜交法進行診斷。

（四） HLA基因多態性檢測
　采用PCR擴增產物的反相雜交（斑點雜交）進行HLA基因多態性檢測十分簡便、有效。將每個位點的所有寡核苷酸探針固定在固相支持物上，引物先經生物素化后，進行待測DNA的基因擴增，從而得到生物素化的DNA放大產物。用此產物與膜上的探針雜交，然后進行顯色或化學發光。這樣每個樣本只需雜交一次即可完成。此方法適合骨髓移植的HLA基因配型及HLA基因與疾病相關性分析等。

（五） 腫瘤細胞多藥耐藥基因的檢測
　多藥耐藥性（multidrug 　resistance,　MDR）是指腫瘤細胞接觸了一種藥物以后，不但對該藥產生耐藥性，而且對其他結構的作用機制不同的藥物也產生耐藥性。研究發現，MDR的出現常與多藥耐藥基因（MDR1）過度表達有關，目前已建立Northern印跡法、斑點和狹縫印跡法、RT-PCR法及原位雜交法，從mRNA水平對患者進行測定，了解腫瘤細胞的耐藥特性。有研究表明，急性髓細胞白血病MDR1的表達與預后有密切相關，即MDR1陽性者CR率低，生存期短，且易早期復發。

（六） 基因治療
　基因治療的目的是應用DNA重組技術和基因轉移技術，把野生型的基因導入患者體細胞內，成為正常的基因產物，來補償缺陷基因的功能，從而使疾病得到糾正。目前認為基因治療的靶細胞是造血干細胞或間質干細胞等。常用的載體是逆轉錄病毒和腺病毒。采用含人因子Ⅸ基因逆轉錄病毒載體轉染血友病B患者的原代皮膚成纖維細胞，使其表達一定濃度的因子Ⅸ，這將為血友病B治療提供新的方法。