液態活檢應用于肺癌診斷，開啟精準治療新時代

　　過去二十年間，隨著對肺癌相關研究的深入，化療、靶向治療、免疫治療等治療手段不斷推陳出新，肺癌治療水平得到了長足進步。而肺癌患者的精準治療離不開分子生物學及診斷科技的發展，液態活檢作為新興的檢測技術在肺癌臨床中的應用日趨成熟。

　　日前，在深圳舉辦的“第六屆羅氏診斷全國腫瘤高峰論壇”上，沈陽市肺癌診治中心、沈陽市胸科醫院腫瘤內科主任李茵茵就液態活檢在肺癌中的臨床應用進行了分享，她指出：“液態活檢已成為組織活檢的有力補充。在部分應用場景中，液態活檢相比組織活檢具有更大的優勢，有助于進一步提高肺癌的精準診斷和個體化治療水平。”

沈陽市肺癌診治中心、沈陽市胸科醫院腫瘤內科主任李茵茵

　　從組織活檢到液態活檢，肺癌精準診斷進階

　　組織活檢作為腫瘤診斷的“金標準”，在臨床實踐中仍存一定的局限性，包括組織活檢的滯后性、部分患者因自身條件不適合組織活檢、有創的組織活檢可能加速腫瘤轉移風險、已發生轉移的癌癥患者組織取樣可能無法反映患者整體情況等1。此外，就肺癌而言，肺癌同一瘤體的不同位置、腫瘤細胞的分化與基因型均存在差異，是一種高度異質性的腫瘤2。當發生疾病進展、藥物耐藥或癌細胞轉移時，腫瘤細胞的亞克隆不斷變化，異質性情況更加多元，組織活檢因而難以完全覆蓋臨床的需求3，4。

　　液態活檢通過取樣腦脊液、唾液、胸水、血液、腹水、尿液等對疾病進行診斷，能在一定程度上避免組織異質性對腫瘤分子分型的影響。基于血液的液態活檢是目前最主要的研究方向，主要檢測血液中游離的循環腫瘤DNA（ctDNA）、循環腫瘤細胞（CTC）和外泌體（Exosome）。

　　ctDNA由腫瘤細胞釋放到血液中，往往帶有腫瘤組織的基因突變信息，能夠檢測到包含點突變（SNV）、短片段插入缺失（Indel）、融合基因（Fusion）、拷貝數變異（CNV）等各類基因突變，可有效覆蓋臨床用藥所需位點的檢測。而CTC通常包含更多的信息，如更完整的轉錄組、蛋白表達等，但相較于已較為成熟的ctDNA提取和檢測，將CTC從大量血細胞中富集出來并加以檢測的流程更加復雜。若能獲得存活的CTC，對后續個體化醫療動物模型構建將有較大幫助5。

　　李茵茵主任介紹道：“相較于組織活檢，液態活檢技術具有三大明顯優勢：一是血檢樣本可及性更高，可以提升很多晚期和復發患者的樣本可及性，規避組織活檢存在的潛在臨床風險；二是能夠避免組織樣本異質性與取材的風險，同一腫瘤的不同位置、原發灶與轉移灶的分子分型都可能存在差異，而組織活檢可能無法對整個腫瘤區域進行全覆蓋；三是可多次取樣，更易于實現術后微小殘留病灶（MRD）以及治療效果的動態監控。”

　　分子診斷指導肺癌全程管理，助推精準醫療發展

　　肺癌液態活檢技術主要包括數字PCR（dPCR）、實時定量PCR（qPCR）和二代測序（NGS）三種。其中，dPCR通常用于單位點檢測；qPCR用于單基因多位點檢測；NGS則可同時檢測大量基因的不同突變類型。

　　qPCR是目前最為成熟的液態活檢技術，當前主要應用于檢測ctDNA中的表皮生長因子受體（EGFR）突變。以新一代cobas? EGFR突變檢測（cobas? EGFR Mutation Test v2）為例，其采用等位基因特異擴增（ASA），利用PCR引物的3’端末位堿基必須與其模板DNA互補才能有效擴增的原理，設計等位基因特異性PCR擴增引物，只有在引物3’堿基與模板配對時才能出現PCR擴增帶，使ASA引物在野生型DNA上不擴增，減少假陽性率。

　　一項多中心、開放標簽、隨機化III期研究試驗ENSURE，用于評估厄洛替尼與吉西他濱/順鉑作為EGFR 19 Del/L858R IIIB / IV期非小細胞肺癌（NSCLC）患者一線治療方案的療效和安全性，結果表明經cobas? EGFR Mutation Test v2血漿檢出EGFR激活突變的晚期NSCLC患者一線使用厄洛替尼治療后，無進展生存期（PFS）比化療有顯著提升6。另一項II期、多中心研究AURA2試驗的匯總分析得出，通過cobas? EGFR Mutation Test v2檢測到血漿T790M陽性的晚期NSCLC 患者可以從一代EGFR-TKI藥物奧希替尼治療中獲益7。

　　cobas? EGFR Mutation Test v2可識別18-21號外顯子區域42種基因突變，包括L858R、19號外顯子缺失、L861Q等TKI敏感性突變和包括T790M在內的TKI耐藥性突變，是市場上覆蓋點位最多的EGFR檢測，有助于臨床鑒別出更多能從靶向治療獲益的患者。

　　此外，NGS技術可獲得 ctDNA 中各個基因的突變信息，有助于進一步避免腫瘤異質性問題，全面分析腫瘤突變情況，同時在用藥監測、MRD監測、血液腫瘤突變負荷（bTMB）監測等方面為臨床提供更多的決策依據8。然而，NGS在實際應用中仍存在一些問題：如從每份血樣中提取獲得的游離DNA（cfDNA）都相對較少，樣本量有限；cfDNA中僅有極小的部分是ctDNA，存在背景噪音；不同研究對象之間的腫瘤特異性突變也有所不同；同時NGS文庫制備流程復雜，各個環節的PCR都可能引入潛在的擴增錯誤，從而影響檢測準確性9。

　　羅氏診斷CAPP-Seq深度測序技術通過在文庫構建、數據分析等環節的優化，引入單分子標簽方案，有效提升了NGS技術用于檢測ctDNA中EGFR突變的特異性與敏感性。

　　基于AVENIO Surveillance 197 panel動態監測肺癌MRD的臨床試驗共入組 40 例 Ib III 期局限性肺癌患者，在治療結束后4個月內首次（MRD界標點）進行血漿ctDNA 分析，之后每3-6個月動態監測ctDNA 水平，結果表明，ctDNA陽性檢測可早于72%的影像學診斷的腫瘤復發，中位時間提前5.2個月。無論在MRD界標點，還是全隨訪病程，ctDNA陽性患者在PFS及疾病特異生存期均顯著低于ctDNA陰性患者。10

　　在免疫治療領域，POPLAR和OAK研究回顧性分析均顯示，當bTMB≥16時，采用 Atezolizumab治療的NSCLC患者臨床獲益顯著優于化療，提示bTMB可作為一個獨立預測生物標志物。11

　　“基于qPCR的液態活檢技術最為成熟，經過充分論證，已大規模應用于臨床。dPCR的超高靈敏度在血檢中有一定優勢，但一次檢測位點較少可能限制其后續的應用場景。而基于NGS的液態活檢通過動態監測等應用場景，有助于患者的全流程管理，后續有較大潛力，但由于其技術的復雜性，其應用仍需進一步論證與優化。”李茵茵主任總結道，“未來，隨著分子生物學技術的進一步發展革新，液態活檢的檢測靈敏度和特異性將不斷提高，液態活檢必將成為腫瘤精準醫療中的重要一環。”

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　　參考資料：

　　[1] Lim C, Sung M,Shepherd FA, et al. Patients with advanced non-small cell lung cancer: are research biopsies a barrier to participation in clinical trials? [J] Thoraconcol, 2016, 11(1): 79-84.

　　[2] Jamal Hanjani , Mariam, et al. "Tracking the evolution of non smallcell lung cancer." New England Journal of Medicine 376.22 (2017):2109-2121

　　[3] Lee, Geewon ,et al. Radiomics and its emerging role in lung cancer research, imaging biomarkers and clinical management: state of the art." European journa lof radiology 86 (2017): 297 307.

　　[4] Govindan , Ramaswamy . "Attack of the Science 346.6206 (2014): 169170.

　　[5] Pantel, Klaus,and Catherine Alix Panabières . "Liquid biopsy and minimal residual disease latest advances and implications for cure." Nature Reviews Clinical Oncology (2019):1

　　[6]cobas? EGFR Mutation Test v2 CE-IVD Package Insert v4

　　[7] Jenkins, et al. J Thoracic Oncol 2017

　　[8] Pantel, Klaus,and Catherine Alix-Panabières. "Liquid biopsy and minimal residual disease—latest advances and implications for cure." Nature Reviews Clinical Oncology (2019): 1.

　　[9] Corcoran, RyanB., and Bruce A. Chabner. "Application of cell-free DNA analysis to cancer treatment."New England Journal of Medicine 379.18 (2018): 1754-1765.

　　[10] Chaudhuri A A,Chabon J J, Lovejoy A F, et al. Early detection of molecular residual diseasein localized lung cancer by circulating tumor DNA profiling[J]. Cancer discovery, 2017, 7(12): 1394-1403.

　　[11] Gandara, DavidR., et al. "Blood-based tumor mutational burden as a predictor of clinical benefit in non-small-cell lung cancer patients treated with atezolizumab.”Nature medicine 24.9 (2018): 1441.