MALDITOFMS在中段尿樣本細菌直接檢測中的應用

引言

基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)是近些年發展起來的一種新型的細菌鑒定技術。它主要根據不同細菌具有不同的蛋白質指紋圖譜, 通過Biotyper鑒定系統將獲得的蛋白質指紋圖譜與數據庫中已知的各菌種的標準圖譜進行比對, 從而完成對各種微生物的鑒定。該方法無需進行常規的革蘭染色、氧化酶、觸酶、生化反應, 僅在幾分鐘之內就可完成鑒定比對, 操作簡便、快速、高通量、低耗材成本。目前MALDI-TOF MS主要應用于對經培養的單個菌落的鑒定, 它能夠快速準確地鑒定臨床常見細菌和真菌, 被認為是最有效率的鑒定方法之一。

MALDI-TOF MS應用于臨床樣本的直接檢測也越來越受到重視。國外已有商品化試劑盒Sepsityper配合MALDI-TOF MS直接用于檢測陽性血培養瓶中的細菌, 無需18~24 h的轉種培養過程, 顯著縮短細菌鑒定時間, 對于臨床血流感染患者及早準確用藥有著重要意義。而MALDI-TOF MS在其它體液樣本(包括尿液)細菌鑒定中的應用報道較少, 本研究旨在應用MALDI-TOF MS快速直接檢測中段尿樣本中的細菌, 以建立合適的方法便于臨床推廣應用。

材料和方法

一、樣本來源

尿液樣本為2014年8至9月浙江大學醫學院附屬第二醫院門診及住院患者無菌采集的中段尿樣本, 共692例, 患者男339例, 女353例, 年齡(42.0± 1.3)歲。

二、試劑和儀器

Microflex LT MS儀購自德國布魯克-道爾頓公司; MALDI-TOF MS所用試劑包括三氟乙酸、α -氰-4-羥基本丙烯酸、色譜級乙腈、甲酸和無水乙醇均購自美國Sigma公司。Vitek 2 Compact全自動微生物分析儀(簡稱Vitek 2 Compact)及其配套的細菌鑒定卡購自法國生物梅里埃公司。哥倫比亞血平板、中國藍平板購自杭州威晟生物科技公司。MALDI-TOF MS校準株為大腸埃希菌DH5α 。Vitek 2 Compact質控菌株為陰溝腸桿菌(ATCC 700323)和鉛黃腸球菌(ATCC 700327)。

三、方法

1. 尿液樣本的常規培養和鑒定

用定量接種環將中段尿樣本接種于哥倫比亞血平板、中國藍平板, 37 ℃ 5%CO₂孵箱中培養18~24 h。待菌落形成后挑取單個菌落均勻涂布于MALDI-TOF MS專用不銹鋼基質靶板上, 進行MALDI-TOF MS快速鑒定。同時按照其操作指南挑取單個菌落制備一定濁度的菌懸液于Vitek 2 Compact上機鑒定。

2. 尿液樣本質譜分析前處理

吸取6 mL尿液樣本于無菌離心管中, 2 000× g離心4 min去除蛋白。離心完畢后盡可能小心地取出離心管, 將上清液轉移至另一無菌離心管中, 在20 ℃下12 000× g離心5 min。棄上清, 在沉淀中加入1 mL 0.45%無菌生理鹽水, 充分震蕩混勻后12 000× g離心5 min。棄上清, 用1 mL去離子水洗滌沉淀, 同樣轉速和時間離心棄上清液。用加樣器吸取1 μ L沉淀均勻涂布于96孔靶板上, 自然干燥待用。

3.MALDI-TOF MS分析

靶板上的每個已點樣的靶點覆蓋1 μ L基質液(50%乙腈+2.5%三氟乙酸配制的飽和α -氰基-4-羥基肉桂酸溶液)。大腸埃希菌DH5α 的蛋白抽提液作為蛋白校準品, 測定時用于儀器的校準和陽性對照。樣本干燥后將靶板放入MALDI-TOF MS儀檢測。儀器參數設置為正線性操作模式, MALDI-TOF MS收集的質量范圍為2 000~20 000, 加速電壓為20 kV, 提取電壓為18.6 kV, 聚焦電壓為6.5 kV, 提取延遲時間為150 ns。每次實驗前都要在采集數據的質量范圍內(2 000~20 000)用校準肽蛋白進行質量校正, 校正完畢后方可進行質譜圖數據的采集, 圖譜采集使用Flex Control 3.0軟件, 圖譜數據比對使用Bruker Biotyper 3.0軟件與標準數據庫進行比對, 使用分值量化和判定結果, 評分> 2.0可鑒定到種的水平, 評分< 2.0而> 1.7可鑒定到屬的水平, 評分< 1.7則表示無法給出可靠的鑒定結果。

結果

一、菌落MALDI-TOF MS鑒定與Vitek 2 Compact鑒定結果的比較

692例中段尿樣本中, 98例只培養到1種細菌且細菌數量> 10⁴ CFU/mL, 菌落MALDI-TOF MS鑒定結果與Vitek 2 Compact上機鑒定結果一致。

二、單一菌感染的中段尿樣本MALDI-TOF MS直接檢測與菌落MALDI-TOF MS鑒定結果的比較

本研究中MALDI-TOF MS直接檢測尿液所得評分> 1.7即認為檢出, 尿液直接MALDI-TOF MS分析得到74個陽性結果, 總檢出率為75.5%, 具體檢出情況見表1。尿培養結果表明, 革蘭陰性菌為尿路感染主要致病菌, 占76.5%, 其中大腸埃希菌最為常見(占50.0%), 肺炎克雷伯菌次之(占15.3%); 革蘭陽性菌相對較為少見, 僅見糞腸球菌(占23.5%)。與培養結果比較, MALDI-TOF MS對不同菌種的檢出情況有所差異, 糞腸球菌、摩根摩根菌、弗勞地枸櫞酸桿菌和克氏枸櫞酸桿菌檢出率較高(100.0%), 肺炎克雷伯菌次之(86.7%), 繼而是大腸埃希菌(79.6%)、鮑曼不動桿菌(50.0%)和陰溝腸桿菌(50.0%)。

三、混合菌感染的中段尿樣本MALDI-TOF MS直接檢測與菌落MALDI-TOF MS鑒定結果的比較

64例尿液樣本培養到2種細菌, 而MALDI-TOF MS直接從44例尿液樣本中檢出優勢生長菌(> 10⁴ CFU/mL), 非優勢菌主要為表皮葡萄球菌、科氏葡萄球菌、無乳鏈球菌、棒狀桿菌、惡臭假單胞菌等常見的污染菌, 具體檢出情況見表2。混合感染樣本中大腸埃希菌最為常見, 共檢出25株, 占混合感染樣本中所有檢出菌株的56.8%。

討論

臨床微生物實驗室中, MALDI-TOF MS在單菌落鑒定上的應用因其獨特的優勢— — 快速、準確、操作簡便而迅速得到推廣。對于臨床常見菌, MALDI-TOF MS可將84.1%~93.6%的細菌準確鑒定至菌種水平。至于臨床難培養的細菌, MALDI-TOF MS更展現出常規生化反應方法無法企及的優勢。SCHMITT等報道MALDI-TOF MS可將70.8%的厭氧菌準確鑒定到種, 91.7%準確鑒定到屬。隨著數據庫的不斷擴充, MALDI-TOF MS對軍團菌、分枝桿菌等苛養菌和緩生菌的鑒定能力越來越強。近年來, MALDI-TOF MS開始被應用于細菌耐藥性研究, 主要用于檢測革蘭陰性桿菌中的β -內酰胺酶尤其是碳青霉烯酶。我們成功應用MALDI-TOF MS檢測腸桿菌科細菌KPC-2型碳青霉烯酶和克雷伯菌屬細菌中外膜蛋白OmpK36的缺失。

MALDI-TOF MS對體液樣本細菌的直接檢測逐漸開始應用, 主要為血培養和尿液樣本。國外學者應用MALDI-TOF MS直接檢測尿液細菌主要關注菌量> 10⁵ CFU/mL的樣本, FERREIRA等報道MALDI-TOF MS直接檢測尿液樣本在菌種水平準確率為91.8%, 而菌屬水平準確率為92.7%。本次研究應用MALDI-TOF MS對菌量> 10⁴ CFU/mL的尿液樣本進行檢測, 總的檢出率為75.5%。世界衛生組織推薦抗菌藥物使用比例不超過30%, 而在中國50.3%的門診患者接受抗菌藥物治療。患者在尿培養之前接受經驗性的抗菌藥物治療可顯著影響尿培養結果。不足量或不正確的抗菌治療可在一定程度抑制細菌在培養基上的生長, 使得尿培養菌落計數偏少。此外, 尿培養結果報告革蘭陰性菌菌量在10⁴ CFU/mL數量級, 對臨床尿路感染的診斷有一定的意義。而MALDI-TOF MS對菌量< 10⁴ CFU/mL的尿液樣本的檢測隨著菌量的減少峰圖信號愈差, 檢測能力降低。因此, 本次研究關注菌量> 10⁴ CFU/mL的尿液樣本。MALDI-TOF MS直接檢測法與菌落MALDI-TOF MS鑒定存在差異, 可能受以下2個因素影響:(1)MALDI-TOF MS直接檢測的尿液樣本經離心處理, 菌與蛋白混于沉淀中且分布不均, 從而導致質譜信號不好; (2)尿液未經過培養增菌, 菌量少, 信號差, 甚至有的樣本菌量低于檢出限而導致MALDI-TOF MS檢測不出, 這可能是影響MALDI-TOF MS直接檢測尿液樣本細菌的主要因素。

在檢測單一菌種的樣本時, MALDI-TOF MS對同一菌種的不同樣本檢測結果各不相同。如49例大腸埃希菌陽性的尿樣本, 26例直接檢測評分> 2.0, 而13例評分介于1.7~2.0之間, 1例評分< 1.7, 剩余9例無圖譜。造成這一現象最主要的原因是菌量多少不一, 菌量多的峰圖信號好, 因而檢測結果可靠, 分值高; 而菌量少的峰圖信號不好, 檢測結果不好, 準確性不高, 至于未檢出的則可能是菌量過少, 低于檢出限, 且蛋白等雜質干擾掩蓋檢測信號。因此, 必須完善質譜前處理流程, 以盡量去除蛋白, 富集細菌, 提高檢出率。

WANG等研究發現尿液樣本中2種菌以1∶ 1或1∶ 2混合時, MALDI-TOF MS直接檢測時能夠同時檢測到2種菌, 而當兩者以1∶ 9比例混合時, 只有優勢菌能夠被檢出。而在本研究中, MALDI-TOF MS檢測混合菌感染的尿液樣本時, 同一樣本中的多種細菌計數在同一數量級時可互相干擾MALDI-TOF MS峰圖導致無法鑒定; 當非優勢菌數量比優勢菌低一個數量級, 且非優勢菌為表皮葡萄球菌、科氏葡萄球菌、無乳鏈球菌、棒狀桿菌、惡臭假單胞菌等可疑污染菌時, 優勢菌的MALDI-TOF MS峰圖受非優勢菌的干擾較少, 甚至幾乎不受干擾。

尿路感染是人類最常見的感染之一, 據文獻報道門診患者中大于80%的尿路感染是由大腸埃希菌引起, 而導管相關性尿路感染是最常見的醫院性感染, 大多由大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌等所致。社區獲得性尿路感染同樣以大腸埃希菌最為常見, 由于中段尿培養需要時間長、費用高, 所以臨床治療尿路感染多以經驗治療為主。臨床上尿液樣本中細菌的鑒定常規方法從培養到鑒定需要36~48 h, 應用MALDI-TOF MS儀只需簡單前處理可直接檢測, 可在2 h內完成菌種鑒定, 比尿培養加MALDI-TOF MS菌落鑒定提前平均20 h, 而比常規的尿培養加Vitek 2 Compact上機鑒定提前平均34~46 h。應用這種快速方法, 可省去耗時的培養過程, 臨床醫生可以提前42 h結合患者癥狀對患者進行診斷并針對病原菌予以合適的抗菌治療, 提高有效治愈率。MALDI-TOF MS直接檢測方法還可克服尿培養結果受前期經驗性用藥影響的缺陷, 幫助臨床醫生及時更改治療方案, 減少經驗性用藥, 防止耐藥菌的產生。MALDI-TOF MS對于混合菌感染的中段尿樣本的檢測更是凸顯一定的優勢, MALDI-TOF MS可報告優勢菌, 省去分離純培養的時間, 相比常規方法可提早46~64 h。毋庸置疑, MALDI-TOF MS直接檢測尿液樣本中的細菌是對基于培養的傳統方法的革命性創舉。雖然目前要獲得藥物敏感性試驗結果仍然需要對尿液樣本進行培養和常規的藥物敏感性試驗, 但MALDI-TOF MS在檢測超廣譜β -內酰胺酶、碳青霉烯酶方面已有應用^[8], 假以時日, MALDI-TOF MS將細菌鑒定和藥物敏感性聯合直接檢測尿液樣本, 將為尿培養細菌的鑒定和藥物敏感性提供更快捷、更準確的途徑。