丹磺酰化法分析蛋白質N末端氨基酸實驗

蛋白質的α-氨基與丹磺酰氯(DNS-Cl 是一種熒光物質) 反應, 生成DNS-蛋白質, 經水解可生成DNS-氨基酸。通過聚酰胺薄膜層析分析DNS-氨基酸, 可確定蛋白質的N-末端氨基酸。此法靈敏度高, 也可用于蛋白質的氨基酸組成的測定。聚酰胺對極性物質的吸附作用是: 它能和被吸附物質間形成氫鍵, 這種氫鍵的強弱決定了被分離物與聚酰胺薄膜之間吸附能力的大小。層析時展層劑與被分離物在聚酰胺膜表面競爭形成氫鍵。因此選擇適當的展層劑使分離物在聚酰胺表面發生吸附、解吸附、再吸附和再解吸附的連續過程, 就能導致分離物達到分離的目的。

蛋白質

氨基酸 丙酮 丹磺酰氯 鹽酸 碳酸氫鈉 甲酸 水 苯 冰醋酸 乙酸乙酯 甲醇 冰乙酸 磷酸三鈉 乙醇 三乙胺

真空干燥器 水解管 烘箱 紫外分析燈 玻璃試管 聚酰胺薄膜

1.  標準氨基酸的丹磺酰化
 

分別稱取2 . 3μmol 層析純的氨基酸, 溶于0 . 5 ml 0 . 2 mol/ L碳酸氫鈉溶液中。取0 . 1 ml 于有塞玻璃試管中, 加入0.1 ml DNS-Cl 丙酮溶液, 檢查pH, 必要時用三乙胺調pH9 . 0～ 9 . 5 ,于室溫(25 ℃ 左右) 下放置2～ 4 h。再用無離子水稀釋10 倍,貯存于暗處。經層析, 得DNS-氨基酸的標準圖譜。

2.  蛋白質N-末端氨基酸的DNS 化
 

取0 . 5 mg 蛋白質樣品, 置于有塞玻璃管中。用少量水溶解后, 加入0 . 5 ml 0 . 2 mol/ L 碳酸氫鈉溶液。再加入0 .5 mlDNS-Cl丙酮溶液, 用三乙胺調至pH9 . 0～9 . 5 , 塞好塞子, 于40 ℃ 烘箱中反應2 h , 或室溫(25 ℃左右)放置2～4 h , 生成DNS-蛋白質。

3.  DNS-蛋白質的水解
 

DNS 化反應結束后, 真空蒸去丙酮, 加入0 . 5 ml 6 mol/ L 鹽酸溶解DNS-蛋白質。全部移入水解管, 抽真空封管, 于111 ℃烘箱中水解18～24 h。開管后蒸去鹽酸, 加少量水, 再蒸干。重復2～3 次以除盡鹽酸。

4.  DNS-氨基酸的抽提
 

將上述水解產物, 加0 . 5 ml 水, 用1 mol/ L 鹽酸調至pH2～3。加入0 . 5 ml 乙酸乙酯抽提, 分層可在細長滴管中進行。重復抽提2～3 次, 將上層抽提液合并于小試管中, 抽去乙酸乙酯,置于干燥器中備用。

5.  DNS-氨基酸的層析與檢測
 

生成的DNS-氨基酸和標準DNS-氨基酸分別進行聚酰胺薄膜層析。
 

（1）聚酰胺薄膜的準備
 

將聚酰胺薄膜剪成7 cm×7 cm 的方塊, 在距邊0 . 5 cm 處畫互為垂直的兩條基線, 交叉點為原點。若只做單相層析, 則只畫一條基線, 在基線上每隔1 cm 畫一點樣點。

（2）點樣
 

用毛細管取樣, 點在點樣位置上, 點樣直徑應小于2 mm。若多次點樣, 則點一次, 吹干一次。

（3）展開
 

將點好樣的聚酰胺薄膜卷成圓筒形, 樣品則在筒內, 箍以線圈固定。放在小層析槽內(可在小干燥器內置一培養皿代替) ,槽內( 培養皿) 放入5～10 ml 展開溶劑Ⅰ , 進行展開, 以溶劑前沿到達距頂端0 . 5 cm 左右為止( 約20 min )。取出膜片, 吹干。進行雙向層析時, 在第一向層析完畢, 完全吹干(有時需晾過夜, 才能充分吹干) , 將聚酰胺薄膜片轉90°, 用展開溶劑Ⅱ 展開。為了區分DNS-蘇氨酸或者區分DNS-天門冬氨酸與DNS-谷氨酸, 可在溶劑Ⅱ展開后, 吹干, 接著用溶劑Ⅲ沿同一個方向展開, 只需展開至一半高度即可。為了區別ε-DNS-賴氨酸、α-DNS-組氨酸與DNS-精氨酸, 應在溶劑Ⅱ 中展開后, 吹干, 接著在溶劑Ⅳ中沿同一個方向展開。

（4）DNS-氨基酸的檢測
 

展開結束后, 取出薄膜, 用電吹風機吹干, 在360 nm 或280 nm的紫外燈下檢測。DNS-氨基酸呈黃色熒光。此外還有其他顏色的雜點, 如DNS-OH 顯綠色熒光等。用樣品的層析譜與標準DNS-氨基酸層析譜相比較, 可鑒別樣品DNS-氨基酸的種類。