傳代細胞培養與觀察

實驗概要

了解傳代細胞的傳代方法及操作過程，學習觀察體外培養細胞的形態及生長狀況。

實驗原理

傳代培養是指細胞從一個培養瓶以1：2或1：2以上的比例轉移，接種到另一培養瓶的培養。

這種培養，第一步也是制備細胞懸液，當細胞長成致密單層時，它很容易被蛋白水解酶和EDTA)所破壞。所以—般采用胰蛋白酶和EDTA(乙二胺四乙酸鹽)的混合物，做為消化液。

細胞培養是一種操作繁瑣而又要求十分嚴謹的實驗技術。要使細胞能在體外長期生長，必須滿足兩個基本要求：一是供給細胞存活所必需的條件，如適量的水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環境酸堿度和滲透壓的調節。二是嚴格控制無菌條件。

主要試劑

L磷酸鹽緩沖液(PBS)

無鈣、鎂溶液

細胞消化液：0.5％胰蛋白酶和0.4%EDTA

EMEM液

3%谷氨酰胺

0.5％臺盤藍染液等

主要設備

解剖剪、解剖鑷、眼科剪(尖頭、彎頭)、眼科鑷(尖頭、彎頭)、培養皿、量筒、試管、錐形瓶、吸管、橡皮頭、培養瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均須徹底清洗、烤干、包裝好，9.9xl0⁴Pa(15磅)滅菌30min備用。

此外，還有顯微鏡、血細胞計數器、血細胞計數板、酒精燈、酒精棉球、碘酒棉球、試管架、標記筆、解剖板等。

實驗材料

喉癌細胞

實驗步驟

在做傳代細胞培養之前，首先將培養瓶置于顯微鏡下，觀察培養瓶中細胞是否已長成致密單層，如已長成單層，即可進行細胞的傳代培養。

1. 營養液配制:

EMEM液                                90%

犢牛血清                                10%

雙抗(1萬單位／m1)                加至約100單位／m1

3％谷氛酞胺                           1m1

7.4％NaHCO₃                         調pH至6.8—7.0

2. 換液:

在酒精燈旁打開瓶塞，倒去瓶中的細胞營養液。

3. 消化與分裝

在上述瓶中加入1mlEDTA溶液，輕輕搖動，將溶液倒出。重復上述動作。加入適量消化液（0.02%EDTA或0.04％EDTA1ml加0.5％胰蛋白酶液0.2ml）以蓋滿細胞為宜，置于室溫，停留1—2min后，翻轉培養瓶，肉眼觀察細胞單層是否出現縫隙(針孔大小的空隙)，如出現縫隙，即可倒去消化液；如末出現縫隙，則可將瓶翻回，繼續進行消化，直到出現縫隙為讓。此時，可倒去消化液，加入新配制的營養液20m1。然后用吸管吸取培養瓶中的營養液，反復吹打瓶壁上的細胞層至瓶壁細胞全部脫落下來為止。此時，可繼續輕輕地吹打細胞懸液，以使細胞散開。隨之進行分裝。

4. 培養

分裝好的細胞瓶上，做好標志，注明細胞代號、日期。置于培養架上，輕搖使細胞均勻分布，以免堆積成團。然后置于37℃培養。

5. 觀察

   1) 觀察體外培養細胞的幾個問題；

細胞培養24h后，即可進行觀察，觀察的重點如下：

      a. 首先要觀察培養細胞是否污染。主要觀察培養液顏色的變化及混濁度

      b. 觀察培養姬顏色變化及細胞是否生長。

      c. 如細胞已生長，則要觀察細胞的形態特征并判斷其所處的生長階段。觀察時可參照2)的描述進行。

      d. 觀察完畢，可用臺盤藍染液對細胞進行染色。以確定死、活細胞的比例。

   2) 細胞的生長階段及其形態特征

傳代培養的細胞需逐日進行觀察，注意細胞有無污染，培養液顏色的變化及細胞生長的情況。—般中層培養的細胞，從培養開始，經過生長、繁殖、衰老及死亡的全過程。它是一個連續的生長過程，但為了觀察及描述，人為地將具分為5個時期，但各期間無明顯絕對界限。現分別描述如下：

      a. 游離期：當細胞經消化分散成單個細胞后，由于細胞原生質的收縮相表面張力以及細胞膜的彈性。所以，此時細胞多為圓形，折光率高，此期可延續數h。

      b. 吸附期(貼壁)：由于細胞的附壁持性，細胞懸液靜置培養一段時間(約7—8h)后，便附著在瓶壁上(此期不同細胞所需時間不同)。在顯微鏡下觀察時可見瓶壁上有各種形態的細胞，如圓形、扁形、短菱形。細胞的特點，大多立體感強，細胞內顆粒少，透明。

       c.  繁殖期：培養l2h以后直到72h，細胞進入繁殖期，加速了細胞生長和分裂。此期包括由幾個細胞形成的細胞島(即由少數細胞緊密聚集而呈現的孤立細胞群，常散在地分布在瓶壁上)，到細胞鋪滿整個瓶壁(即所謂形成細胞單層)的過程。此期細胞形態為多角形(呈現上皮樣細胞的特征)。細胞特點：透明，顆粒較少，細胞間界限清楚，并可隱約見到細胞核。根據細胞所占瓶壁有效面積的百分率，又可將其生長狀況分為四級。以“十”的多少表示如下：

十：細胞占瓶壁有效面積(也就是細胞能生長的瓶壁面積)的25％以內有新生細胞。一般要觀察3—5個視野內的細胞生長狀況，然后加以綜合分析判斷。

十十：細胞占瓶壁有效面積的25—75％以內具新生細胞。

十十十：細胞占瓶壁有效面積的75—95％具新生細胞。細胞排列致密。但仍有空隙。

十十十十：細胞占瓶壁95％以上，細胞已長滿或接近長滿單層，細胞致密，透明度好。

從十十一十十十十為細胞的對數增長期(或稱為指數增長期)。

       d.  維持期：當細胞形成良好單層后，細胞的生長與分裂都減緩，并逐漸停止生長，這種現象被稱為細胞生長的接觸抑制。此時細胞界限逐漸模糊，細胞內顆粒逐漸增多，且透明度降低，立體感較差。由于代謝產物的不斷積累，維持液逐漸變酸。此時營養液已變為橙黃色或黃色。

       e.  衰退期：由于溶液中營養的減少和日齡的增長，以及代謝產物的累積等因素，此時細胞間可出現空隙，細胞中顆粒進一步增多，透明度更低，立體感很差。若將細胞經固定染色處理后，可見細胞中有大而多的脂肪滴及液泡。最后，細胞皺縮，逐漸死亡，從瓶壁上脫落下來。