利用單堿基編輯器實現多位點單堿基編輯DMD及HGPS豬模型

　　6月28日，中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院賴良學課題組在國際學術期刊Nature Communications(《自然-通訊》)發表了題為Efficient base editing for multiple genes and loci in pigs using base editors 的研究論文。首次從細胞、胚胎及動物三個層面探討了單堿基編輯器對豬多基因進行同時點突變的可行性，并且通過體細胞核移植和胚胎注射兩種途徑獲得兩種單位點單堿基突變豬模型(杜氏肌營養不良癥和早衰癥豬模型)和一種三位點單堿基突變豬模型(重癥免疫缺陷豬模型)。該成果的應用將加速生物醫藥相關的大動物豬模型培育和農業精準育種。

　　單堿基編輯器是近年才出現的新基因編輯系統，被認為是基因編輯技術3.0版本。該系統的基本原理是基于脫氨酶的作用，將胞嘧啶(C)轉變為胸腺嘧啶(T)(Cytidine base editors， CBEs)，或將腺嘌呤(A)轉變成鳥嘌呤(G)(adenine base editors，ABEs)，這種堿基間的相互轉換，不會引起雙鏈 DNA 的斷裂，利用其進行基因編輯，更加有效而又安全。而較早期的Cas9等基因編輯工具均會伴隨DNA斷裂，后者會造成基因組的不穩定性，對被編輯的生物機體帶來安全隱患。

　　單堿基編輯器出現以后，很快被廣泛地運用于動物、植物和人細胞的基因編輯。但是，以往的研究主要集中在單位點的堿基突變。而人類遺傳性疾病以及動物遺傳性狀改變往往涉及多個位點的單堿基突變，因此，對基因組的多個位點進行單堿基編輯才更有可能培育出能夠模擬人遺傳性疾病的大動物模型和擁有優良遺傳性狀的畜禽新品系。

　　該研究利用BE3和A3A-BE3兩種單堿基編輯工具，在細胞和胚胎層面，對基因組進行三基因單堿基編輯，每個基因設計一條gRNA，突變成終止密碼子或者突變誘導新的mRNA剪切位點。在胎胚上，三基因同時被編輯效率最高可達50%。而細胞層面，三基因同時編輯最高可達25%。在很多動物體內存在有內源性逆轉錄病毒，這種基因系列相同的內源性病毒往往以多拷貝的形式分布于染色體的不同位點。而豬內源性病毒的存在，給豬作為異種移植器官供體帶來安全隱患。該研究還對與豬內源性病毒復制有關的pol基因進行了單堿基突變，制造提前的終止密碼子，從而實現單基因的多位點失活。通過二代測序分析，可以看到在體細胞內，多拷貝的敲除率達到80%以上，而在胚胎層面，71%病毒拷貝得到敲除。因此，該研究證明，單堿基編輯系統在細胞和胚胎層面均可實現多基因或單基因多位點的高效堿基突變。

　　該研究進一步通過胚胎注射以及體細胞核克隆的途徑分別培育出了單基因突變豬和多基因突變豬。所獲得含有單基因突變的杜氏肌肉營養不良癥(Duchenne muscular dystrophy，DMD)豬模型以及早衰癥(Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome，HGPS)豬模型，均極好地模擬了病人的表型。所獲得的與免疫細胞發育相關的三基因(RAG1、RAG2、IL2RG)純合突變豬的胸腺和脾臟發育有明顯缺陷，T細胞、B細胞及NK細胞缺失，免疫細胞不能進行V(D)J基因組重排，具有典型的重癥免疫缺陷表型。由于豬的免疫系統與人非常相似，這種重癥免疫缺陷豬模型將成為生物醫藥研究領域的重要基因修飾工具豬。

　　該論文的共同通訊作者為研究員賴良學以及副研究員王可品。廣州生物院博士研究生謝精科、葛維凱、栗楠、劉琪帥為共同第一作者。研究工作得到中科院戰略先導專項、國家重點研發計劃、國家自然科學基金、廣東省實驗室、廣東省及廣州市科技計劃、中科院青年創新促進會等的支持。

　　文章鏈接

廣州生物院利用單堿基編輯器在豬上實現多位點單堿基編輯