動物所發現咽囊前體細胞并闡明其特化機制

　　脊椎動物胚胎的一個顯著特征是在頭頸部兩側具有數個明顯的皺襞，稱為鰓弓或咽弓（Pharyngeal Arch）。胚胎的顱面組織和口腔皆由咽弓通過生長、分化、融合和擴張發育而來（圖1）。咽囊（Pharyngeal Pouch）是鰓弓的內胚層組織，位于前腸最前端，是咽區內胚層沿前-后軸依次出芽形成的一系列囊狀凸起（圖2）。咽囊將咽區神經脊細胞分割開來，形成咽部軟骨。咽囊在胚胎發育過程中是一個短暫性的過渡結構，其自身細胞會衍生為顱部及頸部的一些重要器官。例如，中耳腔及耳咽管源自第一對咽囊，腭扁桃體上皮細胞來自第二對咽囊，而胸腺及甲狀旁腺均發育自第三對咽囊。咽囊細胞分泌BMP、FGF等信號分子，作為信號中心指導咽區的骨骼、肌肉、神經系統的細胞命運決定，在脊椎動物頭部組織發育中發揮重要作用。咽囊的發育缺陷與軟腭-心-面綜合征（velo-cardio-facial syndrome, VCFS）、德喬治綜合征（DiGeorge syndrome, DGS）和圓錐動脈干-異常面容綜合征（conotruncal anomaly face syndrome, CAPS）等人類遺傳性疾病密切相關，主要臨床表現為心臟畸形、面容異常、胸腺及甲狀旁腺發育不全、腭裂和低鈣血癥等。因此，深入解析咽囊發育的過程，闡明咽囊發育的分子調控機制，對于理解相關人類遺傳性疾病的發生機理具有重要的科學意義。

　　通過原腸作用，胚胎首先建立起三個胚層，即外胚層、中胚層和內胚層。在隨后的體節期，內胚層細胞向胚體中線匯聚，形成原始腸道（primitive gut tube）。原始腸道沿前后體軸特化為不同的區域，分別稱為前腸、中腸和后腸。前腸不同區域的內胚層細胞在附近中胚層組織的誘導下，分化為表達不同特異基因的前體細胞，最終形成肝臟、胰腺和肺等內胚層器官（圖2）。以往的研究表明，咽囊的形成可分為兩個階段：在起始期（the initiation stage），來自咽區中胚層的Wnt11r在不同區域誘導咽區內胚層細胞粘著性和極性降低，并向腹側遷移；在終末期或變換期（the transition stage），來自咽區外胚層的Wnt4a促進咽囊細胞轉變為緊密有序排列的柱狀上皮細胞，形成成熟的咽囊。前腸內胚層是否存在咽囊前體細胞？如果存在咽囊前體細胞，它們是如何形成的，表達哪些特異的標識基因？目前，對于上述發育生物學領域的基本問題還缺少線索。

　　2月15日，中國科學院動物研究所膜生物學國家重點實驗室研究員王強課題組在PLoS Genetics在線發表了題為BMP signaling is required for nkx2.3-positive pharyngeal pouch progenitor specification in zebrafish 的研究論文。該研究以斑馬魚為模式生物，結合細胞譜系示蹤和轉基因消除（transgenic ablation）技術，揭示了咽囊前體細胞的存在。這些咽囊前體細胞位于咽區內胚層的最外側，表達轉錄因子Nkx2.3。進一步研究發現，來源于鄰近外胚層的BMP2b信號在咽囊前體細胞特化過程具有不可或缺的作用。

　　研究人員首先構建了咽囊特異表達紅色熒光的轉基因斑馬魚Tg(nkx2.3:mCherry)，驚奇地發現早在10體節期的胚胎中即有mCherry表達。通過活體胚胎動態觀察，這些nkx2.3-mCherry+的細胞最初與心肌前體細胞混雜在一起，位于胚胎咽部兩側。在隨后的發育過程中，部分nkx2.3-mCherry+細胞向心臟區域遷移，并參與了心包膜（pericardium）的形成；其他nkx2.3-mCherry+細胞滯留在咽區，經過遷移、增殖和分化，形成了數個咽囊。隨后，通過nkx2.3-EosFP轉基因魚的細胞譜系追蹤實驗表明，大部分咽囊細胞來源于上述這些nkx2.3-mCherry+細胞（圖3），而且通過NTR-MTZ系統誘導nkx2.3-mCherry+細胞凋亡會導致咽囊缺失。表明nkx2.3-mCherry+細胞是咽囊前體細胞更為直接的證據來自于Tg(nkx2.3-mCherry；sox17-GFP)雙轉基因魚胚胎。在這種胚胎中觀測到了綠色的內胚層細胞轉變為紅色的咽囊前體細胞的動態過程，說明咽囊前體細胞由位于邊緣位置的咽區內胚層細胞分化而來。

　　隨后，通過小范圍的信號通路抑制劑篩選和基因敲低或敲除分析，發現BMP信號通路中的BMP2b在咽囊前體細胞特化中發揮關鍵作用。6體節期的咽區外胚層表達并分泌BMP2b蛋白，激活其相鄰的內胚層細胞內的BMP信號通路，致使內胚層細胞發生命運的轉化，特化為咽囊前體細胞（圖4）。有意思的是，過度激活BMP信號并不會增加咽囊前體細胞的數量，說明BMP信號的激活是咽囊前體細胞特化的必要而非充分條件。

　　該研究結果提出了咽囊前體細胞的概念，為系統闡明咽囊前體細胞的命運決定機制奠定了基礎，并且為深入了解相關遺傳性疾病的發生機理提供了重要線索。

　　此外，關于咽囊在指導顱面發育中的關鍵作用，王強課題組在該文發表之前已進行了系統研究，并獲得系列發現。包括：揭示咽囊形成后，其上皮細胞會表達分泌BMP蛋白，而miR-92a在咽區神經嵴細胞表達；mir-92a通過靶向BMP分泌型抑制因子noggin3，精密調節Bmp信號活性，在咽部軟骨發育過程中起重要作用（Developmental Cell, 2013）。發現轉錄因子Dmrt2b特異表達在咽囊中，通過調控cxcl12b和crossveinless 2 的表達，參與顱面神經嵴細胞的聚集、增殖和軟骨分化（Biology Open, 2018）。

　　動物所博士研究生李林蔚為該論文第一作者，王強為論文通訊作者。該研究得到科技部、國家自然科學基金委員會和中科院戰略先導項目的資助。

圖1.：咽弓與顱面形成（引自Helms et al., 2005）

圖2：原始腸道與內胚層器官的形成（引自Aaron et al., 2009）

圖3：(A) 在10體節時期UV刺激右側全部EosFP+細胞，使其由綠變紅。(B和C) 共聚焦成像追蹤光轉化為紅色的EosFP+細胞的命運，在受精后28小時這些細胞發育為單側的咽囊細胞（B）和心包膜細胞（C）。

圖4：咽區外胚層表達并分泌BMP2b蛋白，促進鄰近內胚層細胞特化為咽囊前體細胞的模式圖。