基因的翻譯表達1

1體外TNTRT7 轉錄/翻譯系統表達重組基因

體外翻譯是研究基因表達、基因調控的一類重要技術，該技術可廣泛用于基因表達量、啟動序列等調控因子的確立，并結合PTT實驗篩選天然突變或人工誘變的基因片段，還可用來進行蛋白和DNA結合方面的研究。早期的體外翻譯研究大多是提取mRNA然后通過網織紅細胞或麥胚系統進行蛋白質表達。但目前的轉錄－翻譯系統傾向于將RNA合成酶、核苷酸、緩沖液、RNA酶抑制劑網織紅細胞裂解液混合成復合物，實現從DNA基因片段－蛋白質的全過程。Promega公司的TNTRT7 轉錄/翻譯偶聯快速系統即給研究人員提供了這種方便快速的研究真核基因表達的方法。 TNTRT7 轉錄/翻譯 偶聯快速系統使得真核細胞的體外翻譯實驗更簡單,時間更短。對于大多數真核基因講來,該系統在90分鐘內即可合成2-6fold的蛋白比傳統的網織紅細胞裂解物翻譯系統高的多。 TNTRT7 轉錄/翻譯 偶聯快速系統適合于研究由克隆到T7RNA聚合酶下游的基因編碼的單一結構分子(蛋氨酸缺乏)的轉錄和翻譯。用此系統時,0.2-2微克環狀或現狀DNA分子(如PCR擴增片斷)加到TNTRT7 轉錄/翻譯偶聯快速系統的混合液中(50微升)在30℃保溫60-90分鐘,然后用SDS-PAGE或放射自顯影分析反應物。本實驗即以克隆到T7RNA啟動子下的編碼熒光素酶基因為材料，通過TNTRT7 轉錄/翻譯 偶聯快速系統實現熒光素酶基因的體外表達。

一:儀器：控溫儀、取液器

二:試劑: TNTRT7 轉錄/翻譯、偶聯快速系統試劑盒、蛋氨酸、1mM

三:操作

1從-70℃中將 TNTRT7混合液取出,用手溫融化,迅速放于冰浴,試劑盒中的其他試劑室溫融化后,放于冰浴。

2:在一離心管中依次加入

TNTRT7混合液 40μl,

S-蛋氨酸2μl,

DNA模板1μg

無核酶水到50μl

用槍吸打混勻。

3:30℃保溫60-90分鐘

4:翻譯酶蛋白活性檢測或其他性質分析,放射自顯影或SDS-PAGE分析結果。

2：基因的誘導表達及表達產物的分離

蛋白質是基因產物，在進行基因功能研究、轉基因表達產物鑒定及利用工程菌株生產功能蛋白時都牽涉到外源基因產物的表達。目前基因產物的表達主要是將待表達基因構建到表達載體的特定啟動子下游的多克隆位點，然后將重組載體轉化或轉染受體材料，人工培養并誘導激活啟動子，使外源基因產物得以表達。受體材料主要有細菌、昆蟲、噬菌體及動物細胞等，相對于特定的材料有特定的載體。表達方式主要有融合和非融合表達，啟動子誘導有物理（如熱）和化學（如IPTG）誘導。非融合表達是在載體的啟動子與外源基因的起始密碼之間不存在任何閱讀框架，表達產物即為特定的外源基因產物；融合表達是載體啟動子與外源基因的起始密碼之間有閱讀框架，翻譯產物的起始密碼來自于載體，外源基因是載體閱讀框架的延伸，因此翻譯產物是載體蛋白與外源基因產物的融合體。由于目前融合表達產物中來自于載體部分的蛋白常充當分離過程中的靶蛋白，因此該方法有利于純化表達產物。

本實驗即通過融合和非融合原核表達載體的利用，學習基因的誘導表達技術。

一非融合表達

儀器：搖床、培養箱、超凈臺

材料及試劑：載體為Pet-5a(如圖17－1)，菌株為BL21（DE3），誘導劑為IPTG。