基因表達快速分析新技術

實驗概要

介紹了一種新的基因表達快速分析技術-MPSS 技術的基本原理、技術路線及其優點和應用。

實驗原理

MPSS技術是利用限制性內切酶和熒光檢測知識,發展出的一種辨認和測定細胞每一個cDNA 克隆片段末端16～20bp序列的方法,從而查明細胞內所有基因的表達情況。

MPSS 分析系統大體可劃分為三大部分,如圖1 所示:微球體陣列槽、反應液供排系統和熒光信號處理系統。其中微球體陣列槽主要功能是微球體從槽的一端進入,在槽內緊密排列形成微球體陣列;反應液供排系統主要功能是在連接、酶切、洗脫等過程中自動供排所需的反應液;熒光信號處理系統則主要負責熒光信號的收集和處理,該系統主要由弧光燈源、熒光顯微鏡、CCD 照相機、計算機及相應的數據處理的軟件構成。

實驗步驟

1. 首先將cDNA 模板體外“克隆”到直徑5μm的微球體上。“克隆”的方法主要是利用人工設計長度不同的兩類互補寡核苷酸,分別與cDNA 模板和微球體連接之后,再將cDNA 模板與微球體連接起來。為了能裝載下細胞內所有的cDNA 模板(若以3～4×10⁴ 個基因計算),寡核苷酸的數量至少應該要比模板的量多100 倍以上,為此Brenner 等設計了1167×10⁷ 個片段長32mer 的寡核苷酸,這樣足可以保證生物體所有不同的cDNA 模板都能與不同的寡核苷酸相連接,而且每一個的微球體上也可承載10⁴～10⁵ 個相同的cDNA 拷貝。

2. 用DpnII 酶切處理微球體上的cDNA 模板,形成粘性末端。

3. 用含有II 型限制性內切酶Bbv1 識別位點的不同寡核苷酸接頭與連接在微球體上的cDNA 模板相連接,另外每一種接頭的3’端還帶有一個熒光標記,可與熒光探針雜交,產生熒光信號,該信號可以反映出接頭5’端與模板cDNA 雜交的不同位置上的堿基信息,從而獲取模板cDNA 的序列信息。

4. 分別加入能產生紅黃藍綠雜交信號的四套熒光探針,進行雜交, 每次雜交完畢用洗脫液清洗微球體陣列,除去上一輪雜交的熒光探針。用顯微拍照的方法記錄熒光信號,并將四種信號的圖像輸入計算機儲存。

5. 用II 型限制性酶Bbv1 進一步消化cDNA模板,Bbv1 能在距識別位點約13 個堿基的位置切割cDNA 雙鏈,并在cDNA 模板上產生下4 個堿基末端。

6. 洗脫除去寡核苷酸接頭,經過Bbv1 酶切后的cDNA 模板,進入下一輪分析。重復3～5的步驟4～5 次后,分析所得到的16～20 張熒光顯微照片,就可以讀出微球體陣列中每一個微球體上長度為16～20bp 的cDNA 模板序列。

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