小量細菌克隆的雜交法篩選實驗步驟

發布時間：2019-03-03 11:32 原文鏈接：小量細菌克隆的雜交法篩選實驗步驟

小量細菌克隆的雜交法篩選實驗步驟，一、材料

1. 培養基

含有適當抗菌素的 LB 或 SOB 瓊脂板。

含有氯霉素的 LB 或 SOB 瓊脂板。

2. 專用設備

(1) 硝酸纖維素膜（Millipore HAWP，或類似產品）或尼龍膜。

濾膜不必是無去污劑污染或無菌。

(2) 注射器（3cc )，針頭（18 號）和防水黑色墨汁（India 墨汁）

以上材料用于標記濾膜在主瓊脂板上的方向。

(3) 木制牙簽或接種環。

3. 載體和菌種

E.coli，用于重組質粒轉化。

E.coli，用于非重組質粒轉化（如 pUC，作為陰性對照）。

小量細菌克隆的雜交法篩選實驗步驟，二、方法

1. 將硝酸纖維膜或尼龍膜鋪于含有選擇性抗菌素的瓊脂板（實驗平板）上。

由于手指上的油會影響濾膜浸濕并妨礙 DNA 轉移，操作濾膜時應帶上手套。

2. 在一張繪圖紙上畫出數字標記的方格（方格大小 1 cm2 )，在每一塊瓊脂主板的底部標記數字，并把瓊脂板放在方格紙上，在瓊脂板邊緣的 6 點鐘位置上作好標記。

這樣標記將使主板于方格的方向一致。

3. 用無菌牙簽或接種環將菌落逐一地轉移至實驗板的濾膜上和含有選擇性抗菌素的主板上（沒有濾膜）。按照板下方的方格將菌落劃成 2~3 mm 的短線或點，每一菌落在兩塊板中的位置相同。

一塊 90 mm 板可劃 100 個克隆。

4. zui后在濾膜和主瓊脂板上各劃一個含非重組質粒（如 pUC) 的克隆。

陰性對照對于用放射性探針區別空質粒和重組質粒是必要。從重組質粒的限制酶切產物和瓊脂糖電泳中提取的 DNA 片段常被質粒 DNA 序列污染，當污染的 DNA 片段用作雜交探針進行轉化克隆的 Grunstein-Hogness 篩選時，就會造成麻煩。

5. 倒置瓊脂板置于 37℃ 培養直至菌線的寬度校至 0.5~1.0 mm ( 通常需 6~16 h）。

這一階段，如細菌生長仍然很快，濾膜應轉至含有氯霉素的瓊脂板，再于 37℃ 進一步培養 12 h（Hanahan and Meselson 1980，1983)。這個擴增的過程只有在重組質粒的拷貝數預計很低的情況下（如插入的是較大的外源 DNA 片段 )，或當簡并度較高的寡核苷酸用作探針時，是必要的。克隆的 DNA 片段通常很容易通過雜交被檢出，不需要預先進行重組質粒的擴增。擴增只對那些以松散方式復制的質粒是有效的。

6. 在三個或更多不對稱的位置上標記濾膜，用連在裝有防水墨汁注射器上的 18 號針頭將濾膜刺穿直至實驗板的瓊脂中。在主板相近的位置上也作同樣標記。

實踐中，用空的 18 號針頭在濾膜和下層瓊脂間穿孔而避免使用墨水（墨水會弄得很臟），是可能的，雜交后，通過來自光盒的背光可以對濾旗上的孔與瓊脂上的痕跡進行校對。

很多研究者更喜歡用剪刀在濾膜四周不同位置上剪出缺口的方法來確定方向。將剪出缺口并作好標記的濾膜置于瓊脂表面，而后在培養板背面標記出濾膜鋸齒狀邊緣的位置。這樣通過鋸齒的形狀和位置就可確定在培養板上的方向。

7. 用 Parafilm 膜將主板封好，顛倒后于 4℃ 保存，直至得出雜交實驗的結果。

8. 裂解附著于濾膜上細菌，將釋放出的 DNA 結合到硝酸纖維素膜或尼龍膜上。進行雜交。