小鼠精子畸形試驗

原理>

小鼠精子畸形受基因控制，具有高度遺傳性，許多常染色體及X、Y性染色體基因直接或間接地決定精子形態。精子的畸形主要是指形態的異常，已知精子的畸形是決定精子形成的基因發生突變的結果。因此形態的改變提示有關基因及其蛋白質產物的改變。小鼠精子畸形試驗可檢測環境因子對精子生成、發育的影響，而且對已知的生殖細胞致突變物有高度敏感性，故本試驗可用作檢測環境因子在體內對生殖細胞的致突變作用。

儀器及試劑>

全部試劑除注明外，均為分析純，試驗用水為蒸餾水。
3.1　實驗室常用設備。
3.2　生物顯微鏡。
3.3　甲醇。
3.4　1%～2%伊紅染色液：稱取伊紅1～2g，溶于100mL蒸餾水備用。

實驗步驟>

4.1　動物
6～8周齡(體重25～35g)。
4.2　劑量分組
設一個陰性對照(溶劑)組，一個陽性對照組及三個試驗組，每組至少有5只存活動物。陽性物可采用環磷酸胺40～60mg/(kg·d)或甲基磺酸甲酯(MMS)50mg/(kg·d)，絲裂霉素C(MMC)1.0～1.5mg/（kg·d)。最高劑量可取最大耐受量，或分別取1/2、1/4和1/8LD50作為劑量組。經口給予，連續5d。
4.3　操作步驟
4.3.1　動物處死時間：各種致突變物作用于精子的不同發育階段，可在接觸某種致突變物后不同時間出現精子畸形，故有條件時，可給于受試物后第一、四、十周處死動物，檢查精子形態。因為大部分化學致突變物對精原細胞后期或初級精母細胞早期的生殖細胞較為敏感，故一般均是于首次給受試物后的第35d處死。
4.3.2　用頸椎脫臼法處死小鼠，取出二側副睪，放入盛有適量生理鹽水(1mL)的小燒杯中或放入盛有2mL生理鹽水的平皿中。用眼科剪將副睪縱向剪1～2刀，靜止3～5min，輕輕搖動。用四層擦鏡紙或合成纖維血網袋過濾，吸濾液涂片。空氣干燥后，用甲醇固定5min以上干燥。用1%～2%伊紅染色1h，用水輕沖，干燥。

4.3.3　鏡檢：在低倍鏡下(用綠色濾光片)找到背景清晰精子重疊較少的部位，用高倍鏡順序檢查精子形態，計數結構完整精子。精子有頭無尾(輪廓不清)或頭部與其他精子或碎片重疊，或明顯是人為剪碎者，均不計算，每只動物至少檢查1000個精子。
精子畸形，主要表現在頭部，其次為尾部，畸形類型可分為無鉤、香蕉形、胖頭、無定形、尾折疊、雙頭、雙尾等。異常精子均應記錄顯微鏡的坐標數，以備查詢。并分別記錄異常類型，以便統計精子畸形率及精子畸形類型的構成比。
判斷雙頭、雙尾畸形時，要注意與二條精子的部分重疊相鑒別，判斷無定形時要與人為剪碎及折疊相鑒別。
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統計方法及結果判定>

每個劑量組應分別與相應的陰性對照組進行參數統計方法比較，如用Wilcoson秩和檢驗法評價精子畸形陽性的標準是，畸形率至少為陰性對照組的倍量或經統計有顯著意義，并有劑量反應關系。
一般陰性對照組的精子異常率為0.8%～3.4%，供參考。但應有本實驗室所用實驗動物的自發畸形率作參考。