應用于原代T細胞酪氨酸磷酸化蛋白質組的高靈敏度分析方法

　　應用于原代T細胞酪氨酸磷酸化蛋白質組的高靈敏度分析方法

　　梁富超#, 柯彌#, 田瑞軍*

　　南方科技大學理學院化學系, 廣東 深圳 518055

　　摘要

　　酪氨酸磷酸化在T細胞的信號轉導過程中發揮著重要的作用,然而其豐度較低,鑒定困難。生物組織樣本中分離獲得的原代T細胞數量較少,培養和擴增的難度較大,因而常使用永生化細胞系來研究T細胞的酪氨酸磷酸化介導的信號轉導過程,這通常會導致獲得與原代T細胞相差較大的結論。因此,本研究發展了一種解析原代T細胞酪氨酸磷酸化修飾信號的高靈敏度的蛋白質組學方法。首先,針對原代T細胞數量有限的問題,本研究優化了一套從小鼠脾臟中分離、活化和擴增T細胞的完整流程,第4天時T細胞數量擴增到7倍以上；其次,針對酪氨酸磷酸化修飾豐度較低、不易被質譜檢測的難題,本研究利用SH2超親體(SH2-superbinder)親和富集和固定化鈦離子親和色譜(Ti4+-IMAC)技術對抗CD3和抗CD28單克隆抗體共刺激條件下的原代T細胞多肽樣品進行了酪氨酸磷酸化多肽富集,并結合納升液相色譜-串聯質譜(nanoLC-MS/MS)進行解析。最終成功從1 mg蛋白質中鑒定到282個酪氨酸磷酸化位點,其中包含T細胞受體膜蛋白CD3胞內區的免疫受體酪氨酸激活序列(ITAM)上的多個酪氨酸磷酸化位點,以及信號轉導相關蛋白ZAP70、LAT、VAV1等的重要位點信息。綜上,本研究發展了一套深度解析原代T細胞中的酪氨酸磷酸化修飾的高靈敏度蛋白質組學分析流程,有望應用于繪制更接近生理狀態下的信號轉導網絡。

　　脾臟CD3+T細胞的分離培養

　　脾臟CD3+T細胞的磁珠分選

　　對C57BL/6J小鼠進行脫頸椎處死,迅速置于75%的酒精中進行表面消毒。使用滅菌器械迅速將小鼠的脾臟解剖取出,將脾臟組織置于4 ℃預冷的磷酸鹽緩沖液中備用。

　　將70 μm的細胞篩網置于50 mL離心管上,用1 mL冰冷的磷酸鹽緩沖液對篩網進行潤洗；將解剖出的脾臟組織置于細胞篩網上,使用注射器活塞研磨,同時向篩網上方加入預冷的磷酸鹽緩沖液潤洗,直至組織完全磨碎。將組織研磨液以400 g離心5 min,吸棄上清液。使用磷酸鹽緩沖液將細胞進行重懸,使細胞密度達到1×108 cell/mL。按照STEMCELL公司的小鼠CD3+T細胞分選試劑盒說明書對CD3+T細胞進行分選,吸取分離得到的細胞,以400 g離心5 min,棄去上清液。

　　原代T細胞的活化培養

　　配制T細胞培養基,其主要成分為RPMI 1640空白培養基、10%(v/v)胎牛血清、1%(v/v)鏈霉素-青霉素混合液、50 μmol/L β-巰基乙醇和2 ng/mL 小鼠重組白細胞介素-2(IL-2)。

　　對培養T細胞的孔板進行抗體包被,用磷酸鹽緩沖液對抗CD3和抗CD28抗體進行稀釋,使兩種抗體的最終質量濃度均為1 μg/mL,將配制好的抗體稀釋液置于24孔板中,每孔1 mL, 4 ℃孵育過夜(14 h以上)。

　　棄去24孔板中的抗體稀釋液,然后在每孔中種入1 mL密度為1×106 cell/mL的細胞。活化2天后,將細胞收集到離心管中,以500 g離心10 min,將細胞用配制好的T細胞培養基重懸,進行擴增培養。

　　流式細胞術檢測

　　使用細胞計數板對擴增得到的細胞進行計數,取1×106個細胞,以500 g離心5 min,收集細胞沉淀,加入1 mL流式染色緩沖液吹打混勻,以400 g離心5 min,棄去上清液,加入80 μL流式染色緩沖液進行重懸,加入2 μL CD3-BV510或CD25-PE抗體混勻,室溫避光孵育20 min。隨后加入2 mL流式染色緩沖液輕柔洗滌細胞,以500 g離心5 min,棄去上清液,使用500 μL流式染色緩沖液重懸,上機檢測。

　　原代CD3+T細胞的抗體刺激

　　將培養4天后的T細胞離心收集,使用不含胎牛血清(FBS)的RPMI 1640空白培養基對細胞饑餓處理4~6 h,重懸并計數,使每個樣本細胞數量為1×108個(對照組3組,抗體刺激組4組),離心后使用1 mL RPMI 1640空白培養基重懸。放置冰上10 min,向其中加入5 μg/mL的抗CD3和抗CD28單克隆抗體,在37 ℃水浴鍋中孵育5 min。孵育結束后,迅速向其中加入5×RIPA裂解緩沖液,置于冰上10 min。使用細胞超聲破碎儀對細胞進行超聲裂解,超聲5 s,停止5 s,有效超聲時間30 s以上。超聲結束后,在4 ℃條件下以12200 r/min離心10 min,取上清液,采用PierceTM 660 nm蛋白定量試劑盒對蛋白質進行定量分析。

　　蛋白免疫印跡檢測

　　使用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠,于每個泳道中加入20 μg蛋白質樣品,120 V恒壓條件下進行蛋白質分離(90 min), 200 mA恒流2 h將蛋白質轉印至0.45 μm孔徑的聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上。PVDF膜用奶粉封閉2 h。使用含有0.1% Tween 20、150 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl的緩沖鹽溶液(TBST)洗滌3次后加入抗磷酸化的ERK1/2抗體,于4 ℃搖床孵育過夜。次日,用TBST緩沖液洗滌3次,每次5 min。然后加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)的二抗,室溫孵育2 h。二抗孵育結束后,使用TBST洗滌3次,每次5 min。最后向PVDF膜加入增強型化學發光顯影液進行顯影。

　　樣品處理

　　蛋白質酶解除鹽

　　從抗CD3和抗CD28兩種單克隆抗體刺激后的原代T細胞蛋白裂解液中取出1 mg的蛋白質,使用甲醇-氯仿法進行蛋白質沉淀。使用500 μL含有8 mol/L尿素的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)對蛋白質沉淀進行復溶。然后加入終濃度為10 mmol/L的二硫蘇糖醇(DTT)(55 ℃, 30 min)和30 mmol/L的碘代乙酰胺(IAA)(室溫,避光,15 min)進行還原烷基化。之后,加入終濃度為30 mmol/L的DTT(室溫,30 min)終止反應。進一步,用7倍溶液總體積的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.5)稀釋樣品,并加入終濃度為1 mmol/L的CaCl2。最后加入胰蛋白酶(酶與蛋白質的質量比為1∶20),于37 ℃酶解16 h后,向酶解溶液中逐步、少量加入10%(v/v)三氟乙酸(TFA, HPLC級)對多肽進行酸化(pH 2~3)。然后高速離心去除沉淀后,收集多肽上清液后使用SPE除鹽柱,按照Waters公司除鹽柱說明書的步驟進行多肽除鹽。

　　酪氨酸磷酸化多肽富集

　　使用免疫親和純化緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.8)、10 mmol/L Na2HPO4、50 mmol/L NaCl)復溶多肽,并利用1 mol/L Tris-HCl緩沖液調節pH至7.5左右,向溶解的肽段中加入帶有工程化的SH2結構域蛋白的微球孵育過夜。使用冰上預冷的免疫親和純化(IAP)緩沖液清洗3次,向其中加入含有500 mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖液洗脫2次,最后加入10%甲酸水溶液將多肽酸化至pH 2~3。使用含有10層C18膜片的200 μL移液器槍頭進行除鹽,除鹽產物使用裝有Ti4+-IMAC填料的200 μL移液器槍頭進一步純化,使用10%氨水進行洗脫。使用裝有3層C18膜片的200 μL移液器槍頭對洗脫下的酪氨酸磷酸化多肽進行除鹽,肽段凍干后,使用12 μL含有4%(v/v)甲酸和5%(v/v)乙腈的水溶液進行復溶

　　nanoLC-MS/MS分析

　　采用Easy nano-LC1200色譜系統,使用內徑為100 μm的20 cm自制毛細管分析柱,其中填充0.5 cm C4樹脂填料(顆粒尺寸為3 μm,顆粒孔徑為12 nm)和19.5 cm C18樹脂填料(顆粒尺寸為1.9 μm,顆孔徑為12 nm),流速為250 nL/min,流動相A相為0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相為含0.1% (v/v)甲酸的90%(v/v)乙腈水溶液。梯度洗脫程序如下:0~2 min, 4%B~8%B； 2~57 min, 8%B~28%B； 57~62 min, 28%B~40%B； 62~64 min, 40%B~97%B； 64~80 min, 97%B。

　　采用納流電噴霧離子源,電壓1800 V,離子傳輸毛細管溫度為300 ℃,以數據依賴采集模式運行。一級質譜參數:掃描范圍為m/z 350~1550,分辨率為120000,自動增益控制目標(AGC target)為3×106,最大注入時間為20 ms。二級質譜參數:分辨率為15000, AGC target為1×105,最大注入時間為40 ms。

　　數據分析

　　使用MaxQuant (版本1.5.5.1)軟件對質譜數據進行分析,使用Uniprot數據庫中的Mus musculus數據庫(2020年10月6日,86477個蛋白質),胰蛋白酶酶解,半胱氨酸烷基化(C,+57 Da)為固定修飾,酪氨酸磷酸化(Y,+79.97 Da)、甲硫氨酸氧化(M,+16 Da)、肽段N端的乙酰化(N-terminal,+42 Da)、天冬酰胺和谷氨酰胺脫酰胺修飾(N/Q,+0.98 Da)為可變修飾。允許最大漏切位點為2。蛋白質和肽段鑒定的錯誤發現率(FDR)控制在1%以內。蛋白質鑒定標準為至少檢測到2個特征性肽段。使用Perseus(版本1.5.5.3)軟件進行數據加工并生成火山圖。

　　結論

　　本研究發展了一種研究原代T細胞酪氨酸磷酸化蛋白質組的高靈敏度分析方法。實現了原代T細胞的分離、活化及擴增培養,通過SH2超親體和Ti4+-IMAC聯用的高靈敏度富集策略,借助nanoLC-MS/MS技術解析了T細胞激活過程中的酪氨酸磷酸化位點變化信息,最終從1 mg的原代T細胞的蛋白起始量中解析了包括T細胞受體蛋白CD3的多個側鏈以及許多胞內信號轉導相關蛋白ZAP70、LAT、VAV1等在內的282個酪氨酸磷酸化位點。

　　大量的研究表明,酪氨酸磷酸化修飾蛋白是許多藥物的重要作用靶點。本研究優化的高度靈敏的蛋白質組學技術能夠從原代T細胞中獲得酪氨酸磷酸化位點信息,將為解析真實的藥物靶標及其結合強度等方面帶來新的認知。