微生物的分離純化及稀釋平板菌落計數（一）

一、實驗原理

稀釋平板測數是根據微生物在高度稀釋條件下固體培養基上所形成的單個菌落是由一個單細胞繁殖而成這一培養特征設計的計數方法，即一個菌落代表一個單細胞。計數時，首先將待測樣品制成均勻的繁殖稀釋液，盡量使樣品中的微生物細胞分散開，使其成單個細胞存在，否則一個菌落就不只是代表一個細胞，再取一定稀釋度、一定量的稀釋液接種到平板中，使其均勻分布于平板中的培養基內。經培養后，由單個細胞生長繁殖形成菌落，統計菌落數目，即可計算出樣品中的含菌數。此記數方法所計算的菌數是培養基上長出來的菌落數，故又稱活菌計數。一般用于某些產品檢定，如根瘤菌劑等產品檢定，生物制品檢驗，土壤含菌量測定及食品、水源的污染程度的檢驗。

自然條件下，微生物常以群落狀態存在，這種群落往往是不同種類微生物的混合體。為了研究某種微生物的特性或者要大量培養和使用某種微生物，必須從這些混雜的微生物群落中獲得純培養，這種獲得純培養的方法稱為微生物的分離與純化。

在自然界中，土壤是微生物生活的良好環境，其中生活的微生物數量和種類都是極其豐富的，因此土壤是人類開發利用微生物資源的重要基地。土壤中的微生物數量、種類與土壤肥力有關，肥沃的土壤中多，貧瘠土壤中少。其生理類群則與土壤的其它理化性質，如通氣、pH有關，例如在通氣良好的菜園土中，好氣性微生物占有絕對優勢。本實驗以菜園土為材料分離土壤中的好氣性細菌，并進行數量測定。

分離微生物時，一般是根據該微生物對營養、pH、氧氣等要求的不同，供給它們適宜的生活條件，或加入某種抑制劑造成只利于該菌種生長，不利于其它菌種生長的環境，從而淘汰不需要的菌種。分離微生物常用的方法有稀釋平板分離法和劃線分離法，根據不同的材料，可以采用不同方法，其最終目的是要在培養基上出現欲分離微生物的單個菌落，必要時再對單個菌落進一步分離純化。在用稀釋平板分離微生物時，還可以同時測定待分離的微生物的數量。

放線菌與細菌同屬原核微生物，是重要的抗生素產生菌，在土壤中的數量僅次于細菌，尤其是在有機質豐富、透氣性好的中性到微堿性土壤中的數量較多。本實驗采用高氏一號瓊脂培養基分離和計數菜園土中的放線菌。

真菌在土壤中的數量次于細菌和放線菌，主要在有機質豐富、透氣性好的偏酸性土壤中較多。分離土壤中的真菌并不難，但由于其菌落大，容易擴展，計數準確性較低。本實驗采用加有氯霉素或慶大霉素和孟加拉紅的馬丁氏培養基分離及計數菜園土中的真菌。按一般資料介紹為鏈霉素，但此種抗生素要先配成一定濃度的溶液，且應于倒平板前才加入培養基中。在此培養基上，放線菌和細菌被氯霉素或慶大霉素和孟加拉紅所抑制，但大多數真菌能夠生存，且其菌落受孟加拉紅的抑制而較小，從而避免了某些真菌的擴散蔓延而帶來的數量上的誤差。

二、實驗材料

1、活材料：蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）菌劑。

2、培養基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基；高氏一號瓊脂培養基；加有氯霉素（或慶大霉素）和孟加拉紅的馬丁氏瓊脂培養基:在1000mL培養基中加入注射用氯霉素2mL，孟加拉紅33.4mg，均于滅菌前加入。

3、材料：肥沃茶園土。

實驗用品

內裝15～20個玻璃珠的90mL無菌水、9mL無菌水、直徑9cm的無菌平皿、1mL無菌吸管、天平、稱樣瓶、記號筆、玻璃刮鏟、經2mm土壤篩過篩的菜園、天平、試管架、無菌稱量紙、酒精燈、火柴、接種環、無菌水。

三、實驗方法

（一）稀釋平板測數法

1、樣品稀釋液的制備

準確稱取待測樣品10g，放入裝有90mL無菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，用手或置搖床上振蕩20min，使微生物細胞分散，靜置20～30s，即成10－1稀釋液；再用1mL無菌吸管，吸取10－1稀釋液1mL，移入裝有9mL無菌水的試管中，吹吸3次，讓菌液混合均勻，即成10－2稀釋液；再換一支無菌吸管，吸取10－2稀釋液1mL，移入裝有9mL無菌水的試管中，也吹吸3次，即成10－3稀釋液；以此類推，連續稀釋，制成10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9等一系列稀釋菌液。

用稀釋平板計數時，待測菌稀釋度的選擇應根據樣品確定。樣品中所含待測菌的數量多時，稀釋度應高，反之則低。通常測定細菌菌劑含菌數時，采用10－7、10－8、10－9稀釋度，測定土壤細菌數量時，采用10－4、10－5、10－6稀釋度，測定放線菌數量時，采用10－3、10－4、10－5稀釋度，測定真菌數量時，采用10－2、10－3、10－4稀釋度。