微生物的染色技術及顯微鏡觀察（一）

一、細菌的簡單染色法
  1 目的
  1.1 學習微生物涂片、染色的基本技術。
  1.2 掌握細菌的簡單染色法。
  1.3 初步認識細菌的形態特征，鞏固學習油鏡的使用方法和無菌操作技術。
  2 原理
  細菌的涂片和染色是微生物學實驗中的一項基本技術。細菌的細胞小而透明，在普通的光學顯微鏡下不易識別，必須對它們進行染色。利用單一染料對細菌進行染色，使經染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態和結構。此法操作簡便，適用于菌體一般形狀和細菌排列的觀察。
  常用堿性染料進行簡單染色，這是因為在中性、堿性或弱酸性溶液中，細菌細胞通常帶負電荷，而堿性染料在電離時，其分子的染色部分帶正電荷，因此堿性染料的染色部分很容易與細菌結合使細菌著色。經染色后的細菌細胞與背景形成鮮明的對比，在顯微鏡下更易于識別。常用作簡單染色的染料有美藍、結晶紫、堿性復紅等。

  當細菌分解糖類產酸使培養基pH下降時，細菌所帶正電荷增加，此時可用伊紅、酸性復紅或剛果紅等酸性染料染色。
  染色前必須固定細菌。其目的有二：一是殺死細菌并使菌體粘附于玻片上；二是增加其對染料的親和力。常用的有加熱和化學固定兩種方法。固定時盡量維持細胞原有的形態。
  3 材料
  3.1  菌種
  枯草芽孢桿菌12～18h營養瓊脂斜面培養物、金黃色葡萄球菌約24h營養瓊脂斜面培養物、大腸桿菌24h營養瓊脂斜面培養物、面包酵母瓊脂斜面培養物。
  3．2  染色劑
  呂氏堿性美藍染液(或草酸銨結晶紫染液)，石炭酸復紅染液。
  3.3  儀器或其他用具
  顯微鏡，酒精燈，載玻片，接種環，玻片擱架、雙層瓶(內裝香柏油和二甲苯)，擦鏡紙，生理鹽水或蒸餾水等。
  4 流程
  涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢。
  5 步驟
  5.1  涂片
  取兩塊潔凈無油的載玻片，在無菌的條件下各滴一小滴生理鹽水(或蒸溜水)于玻片中央，用接種環以無菌操作，分別從枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌和大腸桿菌斜面上挑取少許菌苔于水滴中，混勻并涂成薄膜。若用菌懸液(或液體培養物)涂片，可用接種環挑取2～3環直接涂于載玻片上。注意滴生理鹽水（蒸餾水）和取菌時不宜過多且涂抹要均勻，不宜過厚。

  5.2  干燥
  室溫自然干燥。也可以將涂面朝上在酒精燈上方稍微加熱，使其干燥。但切勿離火焰太近，因溫度太高會破壞菌體形態。
  5.3  固定
  如用加熱干燥，固定與干燥合為一步，方法同干燥。  涂片、干燥和熱固定。
  5.4  染色
  將玻片平放于玻片擱架上，滴加染液1～2滴于涂片上(染液剛好覆蓋涂片薄膜為宜)。呂氏堿性美藍染色1～2min，石炭酸復紅(或草酸銨結晶紫)染色約1min 。
  5.5  水洗
  傾去染液，用自來水從載玻片一端輕輕沖洗，直至從涂片上流下的水無色為止。水洗時，不要水流直接沖洗涂面。水流不宜過急、過大，以免涂片薄膜脫落。
  5.6  干燥
  甩去玻片上的水珠自然干燥、電吹風吹干或用吸水紙吸干均可以（注意勿擦去菌體）。
  5.7  鏡檢
  涂片干后鏡檢。涂片必須完全干燥后才能用油鏡觀察。
  6 結果
  繪制單染色后觀察到的大腸桿菌和藤黃微球菌的形態圖。