微生物純培養與生長量測定（一）

一、微生物純培養技術

微生物在自然界中不僅分布廣，而且種類多，并多是混雜地生活在一起。要想研究或利用某一微生物，必須把混雜的微生物類群分離開來，以得到只含一種微生物的純培養。微生物學中將在實驗室條件下由一個細胞或一種細胞群繁殖得到的后代稱為微生物的純培養。

純培養技術包括兩個基本步驟：① 從自然環境中分離培養對象。② 在以培養對象為生物種類的隔離環境中培養、增殖，獲得這一生物種類的細胞群體。針對不同微生物的特點，有許多分離方法。應用廣的是平板法分離純培養。

（一）、用固體培養基分離純培養

單個微生物在適宜的固體培養基表面或內部生長、繁殖到一定程度可以形成肉眼可見的、有一定形態結構的子細胞生長群體，稱為菌落（colony）。當固體培養基表面眾多菌落連成一片時，便成為菌苔（lawn）。不同微生物在特定培養基上生長形成的菌落或菌苔一般都具有穩定的特征，可以成為對該微生物進行分類、鑒定的重要依據。大多數細菌、酵母菌、以及許多真菌和單細胞藻類能在固體培養基上形成孤立的菌落，采用適宜的平板分離法很容易得到純培養。所謂平板，即培養平板（culture plate）的簡稱，它是指固體培養基倒入無菌平皿，冷卻凝固后，盛固體培養基的平皿。這方法包括將單個微生物分離和固定在固體培養基表面或里面。固體培養基用瓊脂或其它凝膠物質固化的培養基，每個孤立的活微生物體生長、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。常用的分離、培養微生物的固體培養基是瓊脂固體培養基平板。這種由Kock建立的采用平板分離微生物純培養的技術簡便易行，100多年來一直是各種菌種分離的常用手段。

1. 稀釋倒平板法（pour plate method）

先將待分離的材料用無菌水作一系列的稀釋（如1:10、1:100、1:1,000、1:10,000......），然后分別取不同稀釋液少許，與已熔化并冷卻至50℃左右的瓊脂培養基混合，搖勻后，傾入滅過菌的培養皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養一定時間即可出現菌落。如果稀釋得當，在平板表面或瓊脂培養基中就可出現分散的單個菌落，這個菌落可能就是由一個細菌細胞繁殖形成的。隨后挑取該單個菌落，或重復以上操作數次，便可得到純培養。　

2. 涂布平板法（spread plate method）

由于將含菌材料先加到還較燙的培養基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡，而且采用稀釋倒平板法也會使一些嚴格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長，因此在微生物學研究中更常用的純種分離方法是涂布平板法。其做法是先將已熔化的培養基倒入無菌平皿，制成無菌平板，冷卻凝固后，將一定量的某一稀釋度的樣品懸液滴加在平板表面，再用無菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個平板表面，經培養后挑取單個菌落（圖2-4）。

3. 平板劃線法（streak plate method）

用接種環以無菌操作沾取少許待分離的材料，在無菌平板表面進行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續劃線，微生物細胞數量將隨著劃線次數的增加而減少，并逐步分散開來，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經培養后，可在平板表面得到單菌落。

4. 稀釋搖管法（dilution shake culture method）

用固體培養基分離嚴格厭氧菌有它特殊的地方。如果該微生物暴露于空氣中不立即死亡，可以采用通常的方法制備平板，然后置放在封閉的容器中培養，容器中的氧氣可采用化學、物理或生物的方法清除。對于那些對氧氣更為敏感的厭氧性微生物，純培養的分離則可采用稀釋搖管培養法進行，它是稀釋倒平板法的一種變通形式。先將一系列盛無菌瓊脂培養基的試管加熱使瓊脂熔化后冷卻并保持在50℃左右，將待分離的材料用這些試管進行梯度稀釋，試管迅速搖動均勻，冷凝后，在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物，將培養基和空氣隔開。培養后，菌落形成在瓊脂柱的中間。進行單菌落的挑取和移植，需先用一只滅菌針將液體石蠟--石蠟蓋取出，再用一只毛細管插入瓊脂和管壁之間，吹入無菌無氧氣體，將瓊脂柱吸出，置放在培養皿中，用無菌刀將瓊脂柱切成薄片進行觀察和菌落的移植。

（二）、用液體培養基分離純培養

對于大多數細菌和真菌，用平板法分離通常是滿意的，因為它們的大多數種類在固體培養基上長得很好。然而迄今為止并不是所有的微生物都能在固體培養基上生長，例如一些細胞大的細菌、許多原生動物和藻類等，這些微生物仍需要用液體培養基分離來獲得純培養。

通常采用的液體培養基分離純化法是稀釋法。接種物在液體培養基中進行順序稀釋，以得到高度稀釋的效果，使一支試管中分配不到一個微生物。如果經稀釋后的大多數試管中沒有微生物生長，那么有微生物生長的試管得到的培養物可能就是純培養物。如果經稀釋后的試管中有微生物生長的比例提高了，得到純培養物的機率就會急劇下降。因此，采用稀釋法進行液體分離，必須在同一個稀釋度的許多平行試管中，大多數（一般應超過95%）表現為不生長。

（三）、單細胞（孢子）分離

稀釋法有一個重要缺點，它只能分離出混雜微生物群體中占數量優勢的種類，而在自然界，很多微生物在混雜群體中都是少數。這時，可以采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細胞或單個個體進行培養以獲得純培養，稱為單細胞（或單孢子）分離法。單細胞分離法的難度與細胞或個體的大小成反比，較大的微生物如藻類、原生動物較容易，個體很小的細菌則較難。

對于較大的微生物，可采用毛細管提取單個個體，并在大量的滅菌培養基中轉移清洗幾次，除去較小微生物的污染。這項操作可在低倍顯微鏡，如解剖顯微鏡下進行。對于個體相對較小的微生物，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下進行。目前，市場上有售的顯微操作儀種類很多，一般是通過機械、空氣或油壓傳動裝置來減小手的動作幅度，在顯微鏡下用毛細管或顯微針、鉤、環等挑取單個微生物細胞或孢子以獲得純培養。在沒有顯微操作儀時，也可采用一些變通的方法在顯微鏡下進行單細胞分離，例如將經適當稀釋后的樣品制備成小液滴在顯微鏡下觀察，選取只含一個細胞的液體來進行純培養物的分離。單細胞分離法對操作技術有比較高的要求，多限于高度專業化的科學研究中采用。