數字PCR應用（三）

Fluidigm公司于2006年底推出了基于集成流體通路（IFC）芯片的Bio-Mark? 高通量基因剖析系統。

其創新在于集成液體通路技術：應用集成電路制造工藝（光刻）在硅片或石英玻璃上刻上許多微管和微腔體，經過不同的控制閥門控制溶液在其中的活動來完成生物樣品的分液、混合、PCR擴增。

圖8. Bio -Mark? IFC芯片

六．dPCR的應用前景

6.1 痕量核酸檢測

圖 9. 痕量核酸檢測的具體分類

dPCR尤其適合：對靈敏度要求非常高的核酸痕量分析研究；基質復雜樣品中的核酸準確定量（如組織、體液、排泄物等樣品）。

圖10. 痕量核酸檢測相關方法比較

6.1.1 癌癥標志物稀有突變檢測

在一份給定的樣本中，相比于野生型DNA，癌癥相關的突變序列比例較低，經常無法檢測。而憑借其超高靈敏度，dPCR系統可以很容易地定量分析低至0.001%-0.0001%的突變頻率。之前用任何方法都無法實現準確穩定檢測的樣本，現在可以使用dPCR輕松進行定量分析。

是否能夠開發出有效的靶向治療藥物，與突變基因的檢測密切相關。其中（1）攜帶藥物作用突變位點的癌細胞百分比；（2）突變的特定等位基因是否可以被準確檢測到，這兩點都直接影響到靶向治療是否有效。很顯然，在腫瘤均質細胞內檢測單一突變相對簡單，但是如果在異質組織內，在僅存有少量突變存在的情況下，如何準確檢測出突變/稀有變異，或者針對于同一種癌癥中多種亞克隆的準確鑒定，對個性化醫療的發展是一個巨大的挑戰。

案列1. 實現肺癌相關的表皮生長因子受體（EGFR）中T790M突變的檢測，可以更好地評估抗酪氨酸激酶抑制劑的治療。然而，由于其他技術檢測靈敏度有限，無法在高背景EGFR野生型中可靠地檢測到T790M突變。研究人員使用dPCR技術開發出精確度很高的檢測方法，以準確定量T790M的濃度[1]。

圖11. ddPCR可以用EGFR突變的肺癌患者的血漿中游離DNA（cfDNA）為樣本，檢測與EGFR敏感性和藥物抗性相關的突變

6.1.2 致病微生物檢測

精確的病毒載量分析對于闡釋疾病病程，后續治療及療效評估是至關重要的。病毒載量的波動，即使只下降了非常低的水平，意義卻是顯著的。在對病原體的研究中，能否實現準確而可靠的病毒DNA或RNA定量分析，關系到實驗的成敗。

案列2. 研究人員比較了 qPCR 和 dPCR 方法檢測臨床樣本中殘留的人類免疫缺陷病毒（HIV），其中包括功能性治愈的HIV感染嬰兒。研究人員發現，在檢測百萬個細胞內的 HIV DNA拷貝數時，相比于 qPCR，dPCR 的靈敏度提升了5倍；在檢測病毒長末端重復序列時，dPCR比qPCR靈敏提升了20倍[2]。

案列3. 研究人員探索HBV血清學和ddPCR檢測結果與肝細胞癌（HCC）臨床分期和病癥之間的關系中，ddPCR成功的克服了real-time PCR（qPCR）在檢測FFPE處理的肝癌患者組織樣品中HBV DNA時，遇到的準確度、靈敏度和重復性不足的缺點。進而得出以下結論： 1、ddPCR的靈敏度和準確度比real-time PCR更高——131個待測樣品中HBV DNA濃度范圍為1.1~175.5 copies/ul； 2、即使是在24個血清學檢測呈陰性的樣本中也檢測到了痕量的HBV DNA； 3、樣品中HBV DNA的含量與肝細胞癌（HCC）組織的臨床分期一致； 4、ddPCR技術可以用于肝癌的早期無創診斷，病程監控，肝移植、化療或免疫抑制的療效評估[3]。

6.2 與新一代測序（NGS）的無縫對接

相對于NGS， dPCR可以富集待測序樣品中的靶基因; dPCR還可以驗證 / 精確定量測序結果。

圖12. ddPCR和NGS的優勢互補

案列4. 由于人間充質干細胞（MSC）在人體內的含量極低，所以目前應用于臨床治療的MSCs都來源于體外培養。研究人員分別對體外培養p1，p8和p13階段（passage）的來源于人骨髓MSC采用全基因組測序(WGS)。WGS結果顯示在p1和p8階段的培養細胞中沒有拷貝數變異（CNV）和非常低頻的單核苷酸突變(SNV)，但是p13階段的SNCs數目顯著增加，達到677個。采用ddPCR對WGS發現的8個非同義突變進行了確認，結果發現在未經培養的單核細胞內就含有極低頻對應的突變(0.01%)，在p1和p8階段培養的MSC內其突變比例依然處于極低比例狀態(0.1-1%)，但是在p13培養的階段對應突變的比例顯著地上升到(17-36%)[4]。

6.3 基因表達分析

實時熒光定量PCR 常用于檢測基因表達差異，但該方法一般只能檢測出兩倍或者更大的差異。而一些研究則需要檢測低于兩倍的表達變化。dPCR 的檢測精度可達±10%甚至更高，能夠分辨更小的差異。

dPCR尤其適合：基因相對表達變化差異較小（<2倍）的研究；低豐度基因或單細胞的表達分析，以及RNA編輯、等位基因差異表達等研究。

圖13. 基因表達分析相關方法比較

6.4 拷貝數變異分析

圖14. 拷貝數變異

拷貝數變異 (CNV) 分析的目的是確認目的序列的拷貝數是否偏離野生型序列，以及偏差多少。拷貝數變異與疾病（癌癥）、代謝途徑、生物種進化等關系密切。臨床上，CNV可為具體治療方案的制定與修正提供參考；農業及畜牧業，CNV可作為遺傳育種的遺傳標記。

傳統實時熒光定量PCR平臺提供了足夠的分辨率，可以鑒別低拷貝數 (如0至5的拷貝數)；但更高的拷貝數需要更精確的測量，以確定確切的拷貝數。dPCR尤其適用于更高拷貝數分析，檢測精度超過±10%。

參考文獻：

1. Oxnard G R, Paweletz C P, Kuang Y, et al. Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA[J]. Clinical cancer research, 2014, 20(6): 1698-1705.

2. Persaud D, Gay H, Ziemniak C, et al. Absence of detectable HIV-1 viremia after treatment cessation in an infant[J]. New England Journal of Medicine, 2013, 369(19): 1828-1835.

3. Huang J T, Liu Y J, Wang J, et al. Next generation digital PCR measurement of hepatitis B virus copy number in formalin-fixed paraffin-embedded hepatocellular carcinoma tissue[J]. Clinical chemistry, 2015, 61(1): 290-296.

4. Cai J, Miao X, Li Y, et al. Whole-genome sequencing identifies genetic variances in culture-expanded human mesenchymal stem cells[J]. Stem cell reports, 2014, 3(2): 227-233.