數字PCR技術在DNA甲基化檢測中的應用

DNA甲基化是目前研究最多的表觀遺傳修飾之一，發生于CpG二核苷酸序列C5位置的胞嘧啶上，多發生于CpG島上，研究發現，DNA甲基化參與調節多種細胞過程，包括胚胎發育，轉錄，X染色體失活，基因組印跡、染色體穩定性等。

許多研究發現，DNA甲基化在一系列的疾病（如癌癥等）起到十分重要的作用。在癌癥患者中，與正常人體相比，DNA甲基化多發生兩個變化：1、啟動子區域CpG島的高甲基化，導致腫瘤抑制基因沉默；2：重復區域的低甲基化，導致基因組不穩定^1，2。

圖1：DNA甲基化與癌癥的關系¹

DNA甲基化的改變多發生于癌癥早期，在某些特定癌癥中，檢測特異的甲基化標志物有助于癌癥的早期發現，進而大大提高癌癥患者的生存率。目前，美國國家癌癥協會（ACS）在最近更新的結直腸癌篩查指南中建議每3年做一次多靶點糞便DNA的甲基化檢測。因此，急需找到一個靈敏度高、特異性強、操作簡單快捷的方法對臨床樣本DNA甲基化進行檢測。

微液滴數字PCR (ddPCR)是近年來PCR技術的一項新進展，通過微液滴化，終點PCR和泊松分布，數字PCR無需標準曲線即可實現核酸濃度的絕對定量。與實時定量PCR技術（qPCR）對比，數字PCR具有靈敏度高，準確度高、精密度高、重復性高，對PCR抑制劑耐受度高的優勢。

目前，Dawne N等人³使用數字PCR進行DNA甲基化的檢測。結果顯示，數字PCR方法可檢出低至0.5%的SNRPN啟動子甲基化，其線性R²可達到0.9903，且兩次完全獨立的實驗重復性極強。

圖2：ddPCR檢測DNA甲基化的靈敏度、線性范圍³

圖3：ddPCR檢測DNA甲基化的穩定性

（A、B為兩次完全獨立實驗）³

使用ddPCR方法檢測VIM基因啟動子DNA甲基化，其最低靈敏度可達到0.03%，線性R²可達到0.9998。且將ddPCR結果與NGS檢測結果對比，一致性強，所用DNA量更少。

Liesbeth Van Wesenbeeck等人⁴使用ddPCR和qPCR做DNA甲基化線性檢測時，圖4對比結果顯示，在檢測低拷貝DNA時，ddPCR準確性較qPCR更高。

圖4：ddPCR（左圖）與qPCR（右圖）測試高拷貝

（1157拷貝/反應，上圖）與低拷貝（222拷貝/反應，下圖）

DNA甲基化實測值與理論值之差與理論值關系圖⁴

綜上所述，使用ddPCR方法進行DNA甲基化分析時，其靈敏度高，穩定性高，準確性高，可用于檢測血漿游離DNA、FFPE DNA等多種樣本來源的DNA的甲基化狀態。因此，基于ddPCR的甲基化檢測技術將來有潛力應用于腫瘤甲基化標志物的檢測中，輔助臨床診斷和治療，應用于腫瘤早診和篩查領域。

新羿生物專注于微液滴數字PCR全鏈條自主研發，包括芯片、儀器、試劑、軟件等核心產品，目前已申請ZL50余項，開發產品數十項。新羿生物的試劑類產品不僅可以在新羿TD-1數字PCR平臺上使用，而且可以在其他商用微液滴數字PCR平臺上使用，靈敏度高，特異性好，重復性高。新羿生物的微液滴數字PCR技術在檢測過程中全程封閉檢測，不需轉移液滴，可避免交叉污染，方便、準確、靈敏。

隨著人民生活水平的提高，我國結直腸癌(Colorectal Carcinoma, CRC）發病率逐年升高，現在我國發達地區CRC已經是發病率居第二位的惡性腫瘤，成為威脅我國人民健康的一種重大疾病，但是CRC發展相對緩慢，可以通過早期發現而得到根治及預防。新羿結直腸癌甲基化基因檢測試劑盒采用Methyl-ddPCR技術，以CRC糞便樣本DNA為檢測對象，對CRC糞便樣本中多個基因的甲基化狀態同時進行檢測，從而輔助臨床早期診斷結直腸癌。

參考文獻:

1. Keith D. Robertson, “DNA methylation and human disease”. Nature Reviews: Genetics. 2005; 6: 597-610.

2. Ernst J. Kuipers, et al. “Colorectal cancer”. Nature Reviews: Disease Primers. 2015; 1: 1-25.

3. Dawne Shelton, et al. “AACR 2014 - Cross Validation of NGS methylated targets using ddPCR”. https://www.researchgate.net/publication/263043581.

4. Liesbeth Van Wesenbeeck, et al. “Droplt digital PCR is an accurate method to assess methylation status on FFPE samples”. Epigenetics. 2018; 13 (3): 207–213.