機械法分離葉綠體

一、原理

研磨葉片得到的勻漿，經過濾、離心可制備葉綠體。葉綠體的被膜比較脆弱，分離葉綠體應在等滲的緩沖溶液中，0~4℃溫度下進行。葉綠體活力會隨著離體時間延長而不斷下降，因此，分離工作盡可能在短時間內完成。

二、儀器與用具

冰箱；離心機；扭力天平；顯微鏡；pH計；研缽；量筒；移液管；離心管；脫脂紗布等。分離器皿都須在0℃下預冷。

三、試劑

1. 分離介質

含0.33mol/L 山梨醇，50mmol/L Tris-HCl（或Tricine） pH7.6，5mmol/L MgCl2，10mmol/L NaCl，2mmol/L EDTA，2mmol/L 異抗壞血酸鈉。

配法：稱60g山梨醇、6.06g Tris、1g MgCl2·6H2O、0.6g NaCl、0.77g EDTA-Na2、0.4g異抗壞血酸鈉，溶解后用1mol/L HCl調pH至7.6，定容至1000ml。

2. 懸浮和測定介質Ⅰ

0.66mol/L 山梨醇，2mmol/L MgCl2， 2mmol/L MnCl2，4mmol/L EDTA，10mmol/L焦磷酸鈉，100mmol/L Tris-HCl pH7.6。

配法：稱60g山梨醇、0.2g MgCl2·6H2O、0.2g MnCl2·4H2O、0.75g EDTANa2、2.23g Na4P2O7·10H2O、6.06g Tris，溶解后用1mol/L HCl調pH至7.6，定容至500ml。

3. 懸浮和測定介質Ⅱ

測定介質Ⅰ稀釋1倍。

四、方法

1. 選用生長健壯，最好是連續幾個晴天下生長的菠菜葉片，洗凈后去除中脈，放入0~4℃冰箱或冰瓶中預冷。

2. 分離介質30~50ml，置于研缽中，并在冰箱中預冷至現薄冰。

3. 取冷卻的菠菜葉片10~20g，撕碎后放入研缽，用手工快速研磨0.30~1min，注意不要用力過猛，也不必研磨過細，以葉片磨成小塊時即可，研磨后將勻漿用兩層新紗布過濾。

4. 將濾液裝入預冷過的二個離心管，經天平平衡后，用離心機以1000r/min離心2min。

5. 傾去上層液，沉淀即為葉綠體。隨后每管加2ml懸浮和測定介質Ⅱ，并用吸管沖散沉淀。葉綠體懸浮液合并后放冰瓶中備用。

6. 用滴管吸取少量葉綠體，加少量懸浮和測定介質Ⅱ稀釋，置顯微鏡（400~600倍）下，觀察葉綠體的形態。

上述是機械法從葉片中分離葉綠體，此外也可從原生