植物染色體顯帶技術和帶型分析

實驗概要

學習和掌握植物染色體Giemsa顯帶技術和帶型分析方法，進一步鑒別植物染色體組和染色體結構。

實驗原理

對植物有絲分裂中期染色體進行酶解，酸、堿、鹽等處理，再經染色后，染色體可清楚地顯示出很多條深淺、寬窄不同的染色帶。各染色體上染色帶的數目、部位、寬窄、深淺、相對穩定，為鑒別染色體的形態提供依據，也為細胞遺傳學和染色體工程提供新的研究手段。
  植物染色體顯帶技術包括熒光分帶和Giemsa（吉姆薩）分帶兩大類。在植物染色體顯帶上最常用的是Giemsa分帶技術，其中C帶和N帶較為常用。C帶的形成認為是高度重復序列的DNA（異染色質）經酸堿變性和復性處理后，易于復性，而低重復序列和單一序列DNA（常染色質）不復性，經Giemsa染色后呈現深淺不同的染色反應。這種差異反映染色體結構的差異。  

主要試劑

0.05％秋水仙堿溶液，卡諾氏固定液，無水酒精，鹽酸，冰醋酸，Giemsa液，5％氫氧化鋇，2×SSC溶液，1M NaH2PO4溶液，1％纖維素酶和果膠酶混合液，1/15磷酸二氫鉀和1/15磷酸氫二鈉緩沖液等。

主要設備

顯微鏡（附攝影裝置），半異體致冷器，冰箱，恒溫水浴鍋，電子天平，液態氮裝置，容量瓶，試劑瓶燒杯，染色缸，載玻片，蓋玻片等

實驗材料

洋蔥、蠶豆、大麥、黃麻的根尖。

實驗步驟

1、染色體分帶 （1） 材料準備：洋蔥鱗莖發根長50px左右，切取根尖進行預處理。蠶豆種子浸種發芽，待幼根長至75px左右，切取根尖進行預處理。蠶豆主根根尖切去后繼續長出的次生根，可再切取次生根根尖進行預處理。大麥種子發芽至幼根長25px左右，切取白色的幼根進行預處理。
（2） 預處理：洋蔥和蠶豆根尖在0.05％秋水仙堿溶液中預處理2－3h。處理溫度一般為25℃。預處理后須用清水沖洗多次，洗去藥液。
（3） 固定：以上各材料經預處理后，放入卡諾氏固定液中固定0.5－24h，轉換到70％酒精，置于冰箱中保存備用。
（4） 解離：洋蔥、蠶豆根尖在0.1N鹽酸溶液中置于60℃恒溫下處理10~15min。大麥根尖在37℃下用1％果膠酶處理30min，然后在0.1N鹽酸溶液中置于60℃下處理5min。 上述材料用酸處理后，須用蒸餾水沖洗多次，除去殘留酸液，否則將會影響染色體的顯帶效果。
（5） 壓片：與常規的植物染色體壓片方法相同。在45％醋酸中壓片，制成白片。在相差顯微鏡下檢查染色體分散程度，挑選出分裂相多，染色體分散均勻的片子。選出的玻片經液氮、CO2干冰或半導體致冷器凍結，用刀片揭開蓋玻片。置室溫下干燥。
（6）  空氣干燥：脫水后的染色體標本一般需經過4－7天的空氣干燥，再進行分帶處理。不同的材料所需干燥的時間不一樣。洋蔥要求空氣干燥的時間較嚴，未經空氣干燥的染色體不顯帶，干燥一周后經顯帶處理顯示末端帶，干燥半個月后能同時顯示末端帶和著絲點帶。而蠶豆、黑麥、大麥則要求干燥時間不十分嚴格。
（7） 顯帶處理：空氣干燥后的染色體標本即可進行顯帶處理。處理方法不同，可顯示不同的帶型。 C帶HSG法（Hydrochloric acid Saline Giemsa  method）將空氣干燥后的洋蔥、蠶豆染色體標本浸入0.2N鹽酸（25℃左右）分別處理30和60min。用蒸餾水沖洗多次后，在60℃的2×SSC溶液中保溫30min，再用蒸餾水沖洗數次，室溫風干，即可染色。 BSG法（Barium Saline Giemsa method）   將空氣干燥后的黑麥、大麥的染色體標本浸入盛有新配制的5％氫氧化鋇飽和液的染色缸中，在室溫條件下處理5－10min，然后用蒸餾水小心地多次沖洗浮垢后，在60℃的2×SSC溶液中保溫60min，再用蒸餾水沖洗數次，室溫風干，即可染色。 N帶   將黑麥、大麥種子發根25px左右切取，在0℃冰水中預處理24h。卡諾氏固定液中固定半小時以上，1％醋酸洋紅染色液中染色2h，然后在45％醋酸中壓片，冰凍法揭開。爾后在45％醋酸60℃條件下脫色10min，再在95％酒精室溫下脫水10min，氣干過夜。最后在1M  NaH2PO4溶液中95℃恒溫下保溫2min，蒸餾水沖洗，氣干后即可染色。
（8）  吉姆薩染色:吉姆薩母液用1/15M磷酸緩沖液按一定的比例稀釋。例如，10份磷酸緩沖液加1份吉姆薩母液稀釋即為10：1，一般都采用扣染法染色。在一干凈的玻璃板上，對稱放置兩根牙簽或火柴棒，距離與載玻片上的材料范圍相等。將帶有材料的玻片翻轉向下，放在牙簽上，然后沿載玻片一邊向載玻片與玻璃板之間的空隙內緩緩滴入染色液，在室溫下染色。染色時間因材料而異，因吉姆薩染料批號不同、質量上有差異，因此其染色液濃度和染色時間需作適當調整。下列材料的染色濃度和染色時間可供參考。

 (9) 鏡檢和封片:染色后的玻片標本，用蒸餾水洗去多余染料，染色過深可用磷酸緩沖液脫色。室溫下風干后即可鏡檢，挑選染色體帶型清晰的片子，用樹膠封片。   2、染色體帶型分析 經過上述處理的植物染色體標本，可以顯示出C帶或N帶的帶型，一般有以下四種帶型： （1） 著絲粒帶（C帶）  帶紋分布在著絲粒及其附近，大多數植物的染色體可顯示C帶。蠶豆、黑麥、大麥等的染色體著絲粒帶比較清楚，洋蔥染色體的著絲粒帶較淺。
  （2） 中間帶（I帶）  帶紋分布在著絲粒至末端之間，表現比較復雜，不是所有染色體都具有中間帶。
（3） 末端帶（T帶）  帶紋分布在染色體末端。洋蔥和黑麥染色體具有典型的末端帶，而蠶豆、大麥的末端帶不明顯。
（4） 核仁縊痕帶（N帶）  帶紋分布在核仁組織者中心區。蠶豆的大M染色體和黑麥的第Ⅶ染色體具有這種帶型。 同時具有以上四種帶型的叫完全帶，以“CITN”表示，其它稱為不完全帶，有“CIN”和“以CTN”型、“TN”型和“N”型。 根據植物各染色體上顯示的不同帶紋和帶紋的寬窄，可按染色體組型分析的方法對同源染色體進行剪貼排列，繪出模式圖，從而對各染色體的帶型作出分析。