植物激素類物質的生理效應及生物鑒定

生長素、赤霉素、細胞分裂素、乙烯、脫落酸是公認的五大類植物激素，它們對植物都有其獨特的生理效應。在植物激素的早期研究中，多以其生物效應作為定量測定及鑒定的方法。隨著免疫學方法、分光光譜法及色譜法等新技術的發展，生物鑒定法已很少用于植物激素的研究，但這些實驗技術對于了解植物激素的特性仍有重要意義。

一、生長素類物質對根、芽生長的影響

【原理】

生長素及人工合成的類似物質，如萘乙酸等一般在低濃度下對植物生長有促進作用，高濃度則起抑制作用。根對生長素較敏感，促進和抑制其生長的濃度均比芽低些。根據此原理可觀測不同濃度的萘乙酸對不同部位生長的促進和抑制作用。

【儀器與用具】

恒溫培養箱；直徑7CM的培養皿7套，吸量管10Ml 2支，1Ml 1支；圓形濾紙（直徑與培養皿底內徑相同）7張；尖頭鑷子1把，記號筆1支。

【試劑】

10Mg／L萘乙酸（NAA）溶液：稱取萘乙酸10Mg，先溶于少量乙醇中，再用蒸餾水定容至100Ml，配成100Mg／L萘乙酸溶液，將此液貯于冰箱中，用時稀釋10倍。漂白粉適量。

【方法】

1將培養皿洗凈烘干，編號，在1號培養皿中加入已配好的10Mg／L NAA溶液10Ml，在2～6號培養皿中各加入9Ml蒸餾水，然后用吸管從1號皿中吸取10Mg／L NAA溶液1Ml注入2號皿中，充分混勻后即成1Mg／L NAA。再從2號皿吸1Ml注入2號皿中，混勻即成01Mg／L溶液，如此繼續稀釋至6號皿，結果從1號到6號培養皿NAA濃度依次為10mg/L、10mg/L、01mg/L、001mg/L、0001mg/L、00001Mg／L。zui后從6號皿中吸出1Ml棄去，各皿均為9Ml溶液。7號皿加蒸餾水9Ml作為對照。

NAA濃度

（mg/L）根數/粒平均各條根長（cm）*條種子根第二種種子根第三條種子根平均芽長

（cm）2精選小麥種子約200粒左右，用飽和漂白粉上清液表面滅菌20Min，取出用自來水沖凈，再用蒸餾水沖洗三次，用濾紙吸干種子表面水分。在1～7號培養皿中各放一張濾紙，沿培養皿周緣整齊地擺放20粒種子，使胚朝向培養皿中心，加蓋后置20～25℃溫箱中，24～36H后，觀察種子萌發情況，留下發芽整齊的種子10粒。3天后，測定各處理種子的根數、根長及芽長，求其平均值，記入表15-1，確定NAA對根、芽生長具有促進或抑制作用的濃度。
 

二、生長素的生物鑒定——芽鞘伸長法

【原理】

生長素能促進禾本科植物胚芽鞘的伸長。切去頂端的胚芽鞘段，斷絕了內源生長素的來源，其伸長在一定范圍內與外加生長素濃度的對數呈線性關系。因此，可以用一系列已知濃度的生長素溶液培養芽鞘切段，繪制成生長素濃度與芽鞘伸長的關系曲線，以鑒定未知樣品的生長素含量。

【儀器與用具】

恒溫箱；搪瓷盤（帶蓋）1個；貼有毫米方格紙的玻璃板1塊；吸量管10Ml 1支，1Ml1支；鑷子1把；綠色燈泡1個；培養皿（直徑7CM）5套；記號筆1支；細玻璃絲若干；簡易切割刀（用有機玻璃和兩片雙面刀片制成，兩刀片間距6MM）。

【試劑】

漂白粉適量；

含有2％蔗糖的磷酸—檸檬酸緩沖液（PH50）：稱取K2HPO4 1794g，檸檬酸1019g，蔗糖20g，溶于蒸餾水中定容至1L；

吲哚乙酸（IAA）溶液：稱取175Mg IAA，用上述緩沖液溶解并定容至100Ml，為0001Mol／L的IAA溶液。

【方法】

1精選燕麥（或小麥）種子100粒，浸入飽和的漂白粉溶液中20Min，取出后用自來水和蒸餾水洗凈，成橫排擺放在鋪有潔凈濾紙的帶蓋搪瓷盤中。為了使胚芽鞘基部無彎曲，需將搪瓷盤斜放成40°～50°角，使胚傾斜向下，盤中加水并加蓋，置25℃暗室中培養。暗室以綠色燈泡照明。

2播后3天，當胚芽鞘長度為25～35MM時，精選芽鞘長度一致的幼苗50株，用鑷子從基部取下芽鞘，再用切割器在貼有方格紙的玻璃板上切去芽鞘頂端3MM，再向下切取6MM的切段50段，放入蔗糖磷酸緩沖液中浸泡1～2H，以洗去內源生長素。

3取洗凈烘干的培養皿5套，用記號筆編號，向各皿內加PH50的蔗糖磷酸緩沖液9Ml，然后在1號皿中加0001Mol／L的IAA緩沖液1Ml，搖勻，即成10－4Mol／L的IAA溶液；再從1號皿中吸出1Ml注入2號皿，搖勻，即成10－5Mol／L IAA溶液；再從1號皿中吸出1Ml注入3號皿，搖勻，即成10－6Mol／LIAA溶液；依次操作到4號皿，配成10－7Mol／L IAA溶液，并吸出1Ml棄去。5號皿不加IAA作對照。

4從緩沖液中取出胚芽鞘切段，吸去表面水分，將切段套在玻璃絲上，注意仔細操作，勿損傷芽鞘。同一玻璃絲上可以穿2～3段芽鞘，但要留下生長的空隙。每一皿中放入10段芽鞘，加蓋，在25℃暗箱或暗室中培養。以上操作應在綠光下進行。

5培養24H后，取出芽鞘，在毫米方格紙上測量其長度，若能借助于雙目解剖鏡則可提高測量精度。求出每種處理的芽鞘平均長度。以處理芽鞘長度（L）與對照長度（L0）之比（L／L0）為縱坐標，以IAA濃度的對數為橫坐標畫出標準曲線。

6對于未知濃度的生長素提取液或其他類似物溶液，均可按上述步驟求L／L0，查出標準曲線即可求得其濃度或效價。
 

三、細胞分裂素的生物鑒定——蘿卜子葉增重法

【原理】

細胞分裂素有促進蘿卜子葉增大（鮮重增加）的效應。可先做出細胞分裂素濃度與子葉重量增加的關系曲線，再以待測樣品進行對比試驗，就可鑒定樣品中細胞分裂素的濃度或效價。

【儀器與用具】

培養皿（直徑9CM）5套；圓形濾紙5張；搪瓷盤（帶蓋）1個；鑷子1把；手術剪1把。

【試劑】

漂白粉適量；5Mg／L激動素或6-BA溶液。

【方法】

1種子萌發取均勻一致的蘿卜種子200粒，用飽和漂白粉溶液消毒20Min并洗凈，擺放在墊有濾紙并用蒸餾水濕潤過的帶蓋搪瓷盤中，25℃暗中催芽。約30H后，即萌發而展開一大一小兩片子葉。從每個幼苗上切下較小的一片子葉，注意子葉上不能殘留下胚軸。選擇大小一致的子葉50片供試。

2.子葉培養取直徑9CM的培養皿5套編號，并在各培養皿墊一張與皿底大小相同的濾紙，從1號至5號培養皿分別加50、05、005、0005Mg／L的激動素或6-BA水溶液和蒸餾水各3Ml。溶液稀釋方法同IAA（見本實驗項目二），在各個培養皿的濾紙上放10片子葉，蓋好皿蓋，并把培養皿放在墊有濕潤濾紙的搪瓷盤上，用玻璃板將盤子蓋好，以維持高濕度，在熒光燈下25℃培養3天，用分析天平稱每個子葉鮮重，求其平均數。

3.以每一處理的子葉平均重為縱坐標，激動素或6-BA濃度的對數為橫坐標，繪出兩者的關系曲線。用同樣方法以未知樣品溶液培養蘿卜子葉，與標準曲線比較，即能大致確定未知樣品細胞分裂素的含量或生物效價。
 

四、赤霉素的生物鑒定——水稻幼苗法

【原理】

赤霉素能強烈促進水稻幼苗葉片伸長，幼苗株高在一定范圍內同外加赤霉素濃度的對數呈直線關系。因此可用作生物鑒定方法以測定未知樣品的赤霉素含量或效價。

【儀器與用具】

培養皿（直徑9CM）1套；鑷子1把；100Ml高型燒杯12只；吸量管（2Ml）6支。

【試劑】

漂白粉適量；100Mg／L赤霉素溶液。

【方法】

1粒選水稻種子100～200粒，用飽和漂白粉溶液滅菌20～30Min，再用冷開水充分洗凈，放在鋪有潔凈濾紙的培養皿中加冷開水至約浸沒種子厚度的一半，放在25～29℃的室內催芽。4～5天后，精選芽長5MM、高度一致的幼苗60株待用。

2取100Ml高型燒杯12只，每2只為一組，共分6組，按組依次加入蒸餾水、01Mg／L、10Mg／L、10Mg／L、100Mg／L標準赤霉素溶液各2Ml，第六組加入2Ml待測液（待測樣品的赤霉素濃度如果很高，應根據估計的濃度范圍適當稀釋，使稀釋液的赤霉素濃度在05～50Mg／L范圍內）。然后在每一燒杯中放入5株水稻幼苗，燒杯上覆蓋培養皿蓋，放置在27℃左右的散射光下（或日光燈照明下）培養，培養期間可適當補充蒸發掉的水分。當苗高與燒杯高度相近時，將培養皿蓋除去。

35～6天后，當對照的第三片葉子開始伸出時用米尺測量各幼苗第二葉的葉鞘長度，求出平均值，以葉鞘長度為縱坐標，赤霉素濃度的對數為橫坐標作圖，畫出標準曲線，將未知樣品培養的稻苗第二葉鞘長度與標準曲線相比，可大體確定未知樣品赤霉素的濃度和效價。