氨基酸結構和分類（四）

三、一級結構的測定
（一）一級結構
蛋白質的一級結構是指肽鏈的氨基酸組成及其排列順序。氨基酸序列是蛋白質分子結構的基礎，它決定蛋白質的高級結構。一級結構可用氨基酸的三字母符號或單字母符號表示，從N-末端向C-末端書寫。采用三字母符號時，氨基酸之間用連字符（－）隔開。
（二）測定步驟
測定蛋白質的一級結構，要求樣品必須是均一的（純度大于97％）而且是已知分子量的蛋白質。一般的測定步驟是：
1.通過末端分析確定蛋白質分子由幾條肽鏈構成。
2.將每條肽鏈分開，并分離提純。
3肽鏈的一部分樣品進行完全水解，測定其氨基酸組成和比例。
4.肽鏈的另一部分樣品進行N末端和C末端的鑒定。
5.拆開肽鏈內部的二硫鍵。
6.肽鏈用酶促或化學的部分水解方法降解成一套大小不等的肽段，并將各個肽段分離出來。
7.測定每個肽段的氨基酸順序。
8.從第二步得到的肽鏈樣品再用另一種部分水解方法水解成另一套肽段，其斷裂點與第五步不同。分離肽段并測序。比較兩套肽段的氨基酸順序，根據其重疊部分拼湊出整個肽鏈的氨基酸順序。
9.測定原來的多肽鏈中二硫鍵和酰胺基的位置。
（三）常用方法
1. 末端分析
（1）N末端
蛋白質的末端氨基與2,4-二硝基氟苯(DNFB)在弱堿性溶液中作用生成二硝基苯基蛋白質（DNP-蛋白質）。產物黃色，可經受酸性100℃高溫。水解時，肽鏈斷開，但DNP基并不脫落。DNP-氨基酸能溶于有機溶劑（如乙MI）中，這樣可與其他氨基酸和ε-DNP賴氨酸分開。再經雙向濾紙層析或柱層析，可以鑒定黃色的DNP氨基酸。
丹磺酰氯法是更靈敏的方法。蛋白質的末端氨基與5-(二甲胺基)萘-1-磺酰氯(DNS-Cl)反應，生成DNS-蛋白質。DNS-氨基酸有強熒光，激發波長在360nm左右，比DNFB法靈敏100倍。
目前應用最廣泛的是異硫氰酸苯酯(PITC)法。末端氨基與PITC在弱堿性條件下形成相應的苯氨基硫甲酰衍生物，后者在硝基甲烷中與酸作用發生環化，生成相應的苯乙內酰硫脲衍生物而從肽鏈上掉下來。產物可用氣-液色譜法進行鑒定。這個方法最大的優點是剩下的肽鏈仍是完整的，可依照此法重復測定新生的N末端氨基酸。現在已經有全自動的氨基酸順序分析儀，可測定含20個以上氨基酸的肽段的氨基酸順序。缺點是不如丹磺酰氯靈敏，可與之結合使用。
N末端氨基酸也可用酶學方法即氨肽酶法測定。
（2）C末端
a) C末端氨基酸可用硼氫化鋰還原生成相應的α氨基醇。肽鏈水解后，再用層析法鑒定。有斷裂干擾。
b) 
另一個方法是肼解法。多肽與肼在無水條件下加熱，可以斷裂所有的肽鍵，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都轉變為相應的酰肼化合物。肼解下來的C末端氨基酸可用紙層析鑒定。精氨酸會變成鳥氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破壞。
c) 也可用羧肽酶法鑒定。將蛋白質在pH 8.0, 
30℃與羧肽酶一起保溫，按一定時間間隔取樣，用紙層析測定釋放出來的氨基酸，根據氨基酸的量與時間的關系，就可以知道C末端氨基酸的排列順序。羧肽酶A水解除精氨酸、賴氨酸和脯氨酸外所有肽鍵，羧肽酶B水解精氨酸和賴氨酸。
2.二硫鍵的拆開和肽鏈的分離
一般情況下，蛋白質分子中肽鏈的數目應等于N末端氨基酸殘基的數目，可根據末端分析來確定一種蛋白質由幾條肽鏈構成。必須設法把這些肽鏈分離開來，然后測定每條肽鏈的氨基酸順序。如果這些肽鏈之間不是共價交聯的，可用酸、堿、高濃度的鹽或其他變性劑處理蛋白質，把肽鏈分開。如果肽鏈之間以二硫鍵交聯，或肽鏈中含有鏈內二硫鍵，則必須用氧化或還原的方法將二硫鍵拆開。最普遍的方法是用過量的巰基乙醇處理，然后用碘乙酸保護生成的半胱氨酸的巰基，防止重新氧化。二硫鍵拆開后形成的個別肽鏈，可用紙層析、離子交換柱層析、電泳等方法進行分離。
3.肽鏈的完全水解和氨基酸組成的測定。
在測定氨基酸順序之前，需要知道多肽鏈的氨基酸組成和比例。一般用酸水解，得到氨基酸混合物，再分離測定氨基酸。目前用氨基酸自動分析儀，2－4小時即可完成。
蛋白質的氨基酸組成，一般用每分子蛋白質中所含的氨基酸分子數表示。不同種類的蛋白質，其氨基酸組成相差很大。
4.肽鏈的部分水解和肽段的分離
當肽鏈的氨基酸組成及N末端和C末端已知后，隨后的步驟是肽鏈的部分水解。這是測序工作的關鍵步驟。這一步通常用專一性很強的蛋白酶來完成。
最常用的是胰蛋白酶（trypsin），它專門水解賴氨酸和精氨酸的羧基形成的肽鍵，所以生成的肽段之一的C末端是賴氨酸或精氨酸。用丫丙啶處理，可增加酶切位點（半胱氨酸）；用馬來酸酐（順丁烯二酸酐）保護賴氨酸的側鏈氨基，或用1,2-環己二酮修飾精氨酸的胍基，可減少酶切位點。
經常使用的還有糜蛋白酶，水解苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等疏水殘基的羧基形成的肽鍵。其他疏水殘基反應較慢。
用溴化氰處理，可斷裂甲硫氨酸的羧基形成的肽鍵。水解后甲硫氨酸殘基轉變為C末端高絲氨酸殘基。以上三種方法經常使用。
胃蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶。前者水解疏水殘基之間的肽鍵，后者水解疏水殘基的氨基形成的肽鍵。
金葡菌蛋白酶，又稱谷氨酸蛋白酶或V8蛋白酶，水解谷氨酸和天冬氨酸的羧基形成的肽鍵，但受緩沖液影響。在醋酸緩沖液中只水解谷氨酸，在磷酸緩沖液中還可水解天冬氨酸。
梭狀芽孢桿菌蛋白酶，水解精氨酸羧基形成的肽鍵，又稱精氨酸蛋白酶。耐變性劑，可經受6M尿素2小時。可用于水解不易溶解的蛋白。