淋巴細胞增殖功能的測定實驗

實驗方法原理 T細胞、B細胞表面具有識別抗原的受體和有絲分裂原受體，在特異性抗原刺激下可使相應淋巴細胞克隆發生增殖。植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA），抗CD2、抗CD3 McAb作為多克隆刺激劑可選擇性地刺激T細胞增殖；而抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌體（SAC）、脂多糖（LPS，對小鼠有作用）則刺激B細胞發生增殖；美洲商陸（PWM）、腫瘤刺激劑PMA對T、B細胞的增殖均有刺激作用。最近發現，integrin家族中VLA組中某些受體與相應配體結合后也能活化T細胞。目前臨床上最常選用PHA刺激PBMC，根據形態學或氚標記胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）摻入率測定T細胞的增殖水平。

實驗材料 PBMC

試劑、試劑盒 閃爍液RPMI1640CO2孵箱

儀器、耗材 細胞收集儀β液閃儀

實驗步驟

1.  無菌從肝素抗凝血中分離外周血單個核細胞（PBMC）洗滌后用10％FCS RPMI1640調整細胞數為1～2×106 /ml

2.  加入96 孔培養板中，1～2×105 細胞/100 μl/孔，每組設3孔。加入最適劑量PHA，100 μl/孔，同時設不加PHA陰性對照。如觀察細胞因子（如IL-2）或其它刺激物（PMA）對增殖功能的調節作用，則根據加入因子的濃度而確定加入量，一般每孔最終體積為200 μl，37 ℃、5 ％ CO2孵育，66 h

3.  每孔加入0.5～1 μci　3H-TdR（50μl），繼續培養6～12 h

4.  用DYQ-Ⅱ型多頭細胞收集儀收集樣品于"9999"型玻璃纖維濾紙上

5.  烤干后β液閃儀計數

6.  計算

（1）增殖水平直接用CPM值表示。

（2）也可用刺激指數（SI）表示

　　PHA（或實驗組）cpm-機器本底

SI＝───────────────

　　陰性對照組cpm-機器本底

注意事項

1.  注意無菌操作。

2.  PHA、ConA、PWM、LPS等在正式實驗前均需摸索最適劑量或亞適劑量。廠家和批號不同絲裂原作用常有很大差別，如Wellcome公司PHA終濃度最適劑量為1～3 μg/ml，而廣州醫工所PHA約為20～100 μg/ml。

3.  根據實驗需要，對不同種（人、小鼠、大鼠、兔、狗等）不同來源淋巴細胞（胸腺、脾臟、淋巴結、扁桃腺、外周血等）均應進行最適細胞濃度、圈養時間和刺激物濃度的摸索。