淋巴細胞雜交瘤單克隆抗體制備技術2

　檢測抗體的方法應根據抗原的性質、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。

　　常用的方法有:

　　1.　ELISA用于可溶性抗原蛋白質、細胞和病毒等McAb的檢測。

　　2.　RIA用于可溶性抗原、細胞McAb的檢測。

　　3.　FACS熒光激活細胞分類儀用于檢查細胞表面抗原的McAb檢測。

　　4.　IFA用于細胞和病毒McAb的檢測。

　　上述方法均為一般實驗室的常規方法，故在此不介紹具體的實驗過程。

　　可靠的篩選方法必須在融合前建立，避免由于方法不當貽誤整個篩選時機。

　　四、雜交瘤的克隆化和凍存

　　克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。犚r為經過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞；所需要的抗體特異性抗體分泌細胞和其它無關抗體分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開，就需要克隆化。克隆化的原則是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆應盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制，因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快，二者競爭的結果會使抗體分泌的細胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失，從而喪失產生抗體的能力。

　　一　克隆化方案

　　用克隆化的方法很多，而zui常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。

　　1.　有限稀釋法的程序

　　①　制備飼養細胞懸液同融合前準備

　　②　陽性孔細胞的計數，并調細胞數在1～5×10３／ml

　　③　取130個細胞放入6.5ml含飼養細胞完全培養液，即20個細胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排為每孔2個細胞。余下2.9ml細胞懸液補加2.9ml含飼養細胞的完全培養液,細胞數為10個／ml，100μl／孔加D、E、F三排，為每孔1個細胞。余下2.2ml細胞懸液補加2.2ml含飼養細胞的完全培養液，細胞數5個／ml，100μl／孔，加G、H兩排，為每孔0.5個細胞。

　　④　培養4～5天后，在倒置顯微鏡上可見到小的細胞克隆，補加完全培養液200μl／孔。

　　⑤　第8～9天時，肉眼可見細胞克隆，及時進行抗體檢測。

　　注:初次克隆化的雜交瘤細胞需要在完全培養液中加HT。

　　2.　軟瓊脂法

　　①　軟瓊脂的配制

　　含20％FCS小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640

　　1％瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預熱。

　　0.5％瓊脂：由1份1％瓊脂加1份含20％小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。

　　②　用上述0.5％瓊脂液含有飼養細胞15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。

　　③　按100／ml，500／ml或5000／ml等濃度配制需克隆的細胞懸液。

　　④　1ml 0.5％瓊脂液42℃預熱在室溫中分別與1ml不同濃度的細胞懸液相混合。

　　⑤　混勻后立即傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10分鐘，使其凝固，孵育于37℃，5％CO₂孵箱中。

　　⑥　4～5天后即可見針尖大小白色克隆，7～10天后，直接移種至含飼養細胞的24孔板中進行培養。

　　⑦　檢測抗體，擴大培養，必要時再克隆化。

　　二　雜交瘤細胞的凍存

　　及時凍存原始孔的雜交瘤細胞、每次克隆化得到的亞克隆細胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩定分泌抗體的細胞系的時候，細胞的培養過程中隨時可能發生細胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細胞的凍存，則因為上述的意外而全功盡棄。

　　雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞系的凍存方法一樣，原則上細胞應在每支安瓿含1×10⁶以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養環境不同而改變，在24孔培養板中培養，當長滿孔底時，一孔就可以凍一支安瓿。

　　細胞凍存液:

　　50％小牛血清

　　40％不完全培養液

　　10％　DMSO二甲亞砜

　　凍存液zui好預冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降到0℃，再降溫時一般按每分鐘降溫2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中。或細胞管降至0℃ 后放-70℃超低溫冰箱，次日轉入液氮中。也可以用細胞凍存裝置進行凍存。凍存細胞要定期復蘇，檢查細胞的活性和分泌抗體的穩定性，在液氮中細胞可保存數年或更長時間。

　　五、單克隆抗體的大量生產

　　大量生產單克隆抗體的方法主要有兩種：

　　1.　體外使用旋轉培養管大量培養雜交瘤細胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產量低，一般培養液含量為10～60μg／ml，如果大量生產，費用較高。

　　2.　體內接種雜交瘤細胞，制備腹水或血清。

　　①　實體瘤法　對數生長期的雜交瘤細胞按1～3×10⁷／ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2 ml, 共2～4點。待腫瘤達到一定大小后一般10～20天則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達到1-10mg／ml。但采血量有限。

　　②　腹水的制備　常規是先腹腔注射0.5mlPristane降植烷或液體石臘于BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×10⁶個雜交瘤細胞，接種細胞7～10天后可產生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復收集數次。腹水中單克隆抗體含量可達5-20mg/ml， 這是目前zui常用的方法，還可將腹水中細胞凍存起來，復蘇后轉種小鼠腹腔則產生腹水快、量多。

　　六、單克隆抗體的鑒定

　　對制備的McAb進行系統的鑒定是十分必要的。應對其做如下方面的鑒定:

　　1.　抗體特異性的鑒定：除用免疫原抗原進行抗體的檢測外，還應用與其抗原成分相關的其它抗原進行交叉試驗，方法可用ELISA、IFA法。例如①制備抗黑色素瘤細胞的McAb，除用黑色素瘤細胞反應外，還應用其它臟器的腫瘤細胞和正常細胞進行交叉反應，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關抗原的單克隆抗體。②　制備抗重組的細胞因子的單克隆抗體，應首先考慮是否與表達菌株的蛋白有交叉反應，其次是與其它細胞因子間有無交叉。

　　2.　McAb的Ig類與亞類的鑒定：一般在用酶標或熒光素標記的第二抗體進行篩選時，已經基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標或熒光素標記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標準抗亞類血清系統作雙擴或夾心ELISA來確定McAb的亞類。在作雙擴試驗時，如加入適量的PEG3％，將有利于沉淀線的形成。

　　3.　McAb中和活性的鑒定：用動物的或細胞的保護實驗來確定McAb的生物學活性。例如如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時接種于易感的動物或敏感的細胞，來觀察動物或細胞是否得到抗體的保護。

　　4.　McAb識別抗原表位的鑒定：用競爭結合試驗、測相加指數的方法，測定McAb所識別抗原位點，來確定McAb的識別的表位是否相同。

　　5.　McAb親和力的鑒定：用ELISA或RIA競爭結合試驗來確定McAb與相應抗原結合的親和力。

　　七、影響因素、失敗原因分析

　　由于制備McAb的實驗周期長，環節多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會造成失敗。

　　其主要失敗原因和影響因素有:

　　1.　污染：包括細菌、霉菌和支原體的污染。這是雜交瘤工作中zui辣手的問題。一旦發現有霉菌污染就應及早將污染板棄之，以免污染整個培養環境。支原體的污染主要來源于牛血清，此外，其它添加劑、實驗室工作人員及環境也可能造成支原體污染。在有條件的實驗室，要對每一批小牛血清和長期傳代培養的細胞系進行支原體的檢查，查出污染源應及時采取措施處理。對于污染的雜交瘤細胞可以采取生物學的過濾方法，將污染的雜交瘤細胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待長出腹水或實體瘤時，犖^菌取出分離雜交瘤細胞，一般可除去支原體污染。

　　2.　融合后雜交瘤不生長：在保證融合技術沒有問題的前提下主要考慮下列因素①PEG有毒性或作用時間過長。②牛血清的質量太差，用前沒有進行嚴格的篩選。③骨髓瘤細胞污染了支原體。④HAT有問題，主要是A含量過高或HT含量不足。

　　3.　雜交瘤細胞不分泌抗體或停止分泌抗體

　　①　融合后有細胞生長，但無抗體產生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤細胞發生突變，變成A抵抗細胞所致。

　　②　有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。

　　③　對于原分泌抗體的雜交瘤細胞變為陰性，可能是細胞支原體污染，或非抗體分泌細胞克隆競爭性生長，從而抑制了抗體分泌細胞的生長。也可能發生染色體丟失。Goding91982曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗體停止分泌的有效措施。

　　三要:

　　要大量保持和補充液氮凍存的細胞原管。

　　要應用倒置顯微鏡經常檢查細胞的生長狀況。

　　要定期進行再克隆。

　　三不要:

　　不要讓細胞“過度生長”。因為非分泌的雜交瘤細胞將成為優勢，壓倒分泌抗體的雜交瘤細胞。

　　不要讓培養物不加檢查地任其連續培養幾周或幾個月。

　　不要不經克隆化而使雜交瘤在機體內以腫瘤生長形式連續傳好幾代。

　　4.　雜交瘤細胞難以克隆化

　　可能與小牛血清質量、雜交瘤細胞的活性狀態有關，或由于細胞有支原體污染，使克隆化難以成功。若是融合后的早期克隆化，應在培養液加HT。