淋巴細胞雜交瘤單克隆抗體制備技術4

　（二）細胞融合

　　1．細胞融合前準備

　　（1）骨髓瘤細胞系的選擇：骨髓瘤細胞應和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內產生大量McAb。常用的骨髓瘤細胞系見表2-4。

表2-4用于融合試驗的主要骨髓瘤細胞系

　　骨髓瘤細胞的培養可用一般的培養液，如RPMI1640，DMEM培養基。小牛血清的濃度一般在10%～20%，細胞濃度以104～5×105/ml為宜，zui大濃度不得超過106/ml。當細胞處于對數生長的中期時，可按1：3～1：10的比例傳代。每3～5天傳代一次。細胞在傳代過程中，部分細胞可能有返祖現象，應定期用8-氮鳥嘌呤進行處理，使生存的細胞對HAT呈均一的敏感性。

　　（2）飼養細胞：在組織培養中，單個或少數分散的細胞不易生長繁殖，若加入其它活細胞，則可促進這些細胞生長繁殖，所加入的這種細胞數被稱為飼養細胞。在制備McAb的過程中，許多環節　需要加飼養細胞，如在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養過程中，加入飼養細胞是十分必要的。常用的飼養細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞（較為常用）、小鼠脾臟細胞或胸腺細胞。也有人用小鼠成纖維細胞系3T3經放射線照射后作為飼養細胞。飼養細胞的量為一般為2×104或105細胞/孔。

　　2．細胞融合的步驟

　　（1）制備飼養細胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細胞。

　　與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周

↓

　　拉頸 處死，浸泡在75%酒精內，3～5min

　　↓

　　用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜

　　↓

　　用無菌注射器注入5～6ml預冷的培養液（嚴禁刺破腸管）

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　　反復沖洗，吸出沖洗液

　　↓

　　沖洗液放入10ml離心管，1200rpm/分離5～6min

　　↓

　　用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養液混懸，調整細胞數至1×105/ml

　　↓

　　加入96孔板，100μl/孔

　　↓

　　放入37。c CO2孵箱培養

　　（2）制備免疫脾細胞

　　zui后一次加強免疫3天后小鼠拉頸處死

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　　無菌取脾臟，培養液洗 一次

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　　脾臟研碎，過不銹鋼篩網

　　↓

　　離心，細胞用培養液洗2次

　　↓

　　計數

　　↓

　　取108脾淋巴細胞懸液備用

　　（3）制備骨髓瘤細胞

　　取對數生長骨髓瘤細胞離心

　　↓

　　用無血清培養液洗2次

　　↓

　　計數，取得×107細胞備用

　　（4）融合

　　①將骨髓瘤細胞與脾細胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養液洗1次，離心，1200rpm,8min;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略松動。

　　②90s內加入37℃預溫的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖動。37℃水浴作用90s。

　　③加37。C預溫的不完全培養液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。

　　④離心，800rpm, 6min。

　　⑤充上清，用含20%小牛血清HAT選擇培養液重懸。

　　⑥將上述細胞，加到已有飼養細胞層的96孔板內，每孔加100μl。一般一個免疫脾臟可接種4塊96孔板。

　　⑦將培養板置37℃、5%CO2培養箱中培養。

　　（三）選擇雜交瘤細胞及抗體檢測

　　1．HAT選擇雜交瘤細胞　　　脾細胞和骨髓瘤細胞經PEG處理后，形成多種細胞的混合體，只有脾細胞與骨髓細胞形成的雜交瘤細胞才有意義。在HAT選擇培養液中培養時，由于骨髓瘤細胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉移酶，故不能生長繁殖，而雜交瘤細胞具有上述兩種酶，在HAT選擇培養液可以生長繁殖。

　　在用HAT選擇培養1～2天內，將有大量瘤細胞死亡，3～4天后瘤細胞消失，雜交細胞形成小集落，HAT選擇培養液維持7～10天后應換用HT培養液，再維持2周，改用一般培養液。在上述選擇培養期間，雜交瘤細胞布滿孔底1/10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。在選擇培養期間，一般每2～3天換一半培養液。

　　2．抗體的檢測　　 檢測抗體的方法應根據抗原的性質、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。

　　常用的方法有：（1）放射免疫測定（RIA）可用于可溶性抗原、細胞McAb的檢測。（2）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）可用于可溶性抗原、細胞和病毒等McAb的檢測。（3）免疫熒光試驗適合于細胞表面抗原的McAb的檢測。（4）其它如間接血凝試驗、細胞毒性試驗、旋轉粘附雙層吸附試驗等。

　　（四）雜交瘤的克隆化

　　雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。因為經過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞、所需要的抗體（特異性抗體）分泌細胞和其它無關抗體的分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開就需要克隆化。克隆化的原則是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制，因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快，二者競爭的結果會使抗體分泌的細胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失，從而喪失產生抗體的能力。

　　克隆化的方法很多，zui常用的是有限稀釋法和軟瓊脂平板法。

　　1．有限稀釋法克隆

　　（1）克隆前1天制備飼養細胞層（同細胞融合）。

　　2）將要克隆的雜交瘤細胞從培養孔內輕輕吹干，計數。

　　（3）調整細胞為3～10個細胞/ml。

　　（4）取頭天準備的飼養細胞層的細胞培養板，每孔加入稀釋細胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中。

　　（5）在第7天換液，以后每2～3天換液1次。

　　（6）8～9天可見 細胞克隆形成，及時檢測抗體活性。

　　（7）將陽性孔的細胞移至24孔板中擴大培養。

　　（8）每個克隆應盡快凍存。

　　2．軟瓊脂培養法克隆

　　（1）軟瓊脂的配制：含有20%NCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI1640。

　　①1%瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預熱。

　　②0.5%瓊脂：由1份1%瓊脂加1份含20%小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。

　　（2）用上述0.5%瓊脂液（含有飼養細胞）15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。

　　（3）按100/ml，500/ml或5000/ml等濃度配制需克隆的細胞懸液。

　　（4）1ml 0.5%瓊脂液（42℃預熱）在室溫中分別與1ml不同濃度的細胞懸液相混合。

　　（5）混勻后立傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10min，使其凝固，孵育于37℃、5%CO2孵箱中。

　　（6）4～5天 后即可見針尖大小白色克隆，7～10天后，直接移種至含飼養細胞的24孔中進行培養。

　　（7）檢測抗體，擴大培養，必要是地再克隆化。

　　（五）雜交瘤細胞的凍存與復蘇

　　1．雜交瘤細胞的凍存　　 及時凍存原始孔的雜交瘤細胞每次克隆化得到的亞克隆細胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩定分泌抗體的細胞系的時候，細胞的培養過程中隨時可能發生細胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細胞的凍存，則可因上述意外而前功盡棄。

　　雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞系的凍存方法一樣，原則上細胞應在每支安瓿含1×106以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養環境不同而改變，在24孔培養板中培養，當長滿孔底時，一孔就可以裝一支安瓿凍存。

　　細胞凍存液：50%小牛血清；40%不完全培養液；10%DMSO（二甲基亞砜）。

　　凍存液zui好預冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降至0℃后放入-70℃超低溫冰箱，次日轉入液氮中。也可用細胞凍存裝置進行凍存。凍存細胞要定期復蘇，檢查細胞的活性和分泌抗體的穩定性，在液氮中細胞可保存數年或更長時間。

　　2．細胞復蘇方法 　將玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min內使凍存的細胞解凍，將細胞用完全培養液洗滌兩次，然后移入頭天已制備好的飼養層細胞的培養瓶內，置37℃、5%CO2孵箱中培養，當細胞形成集落時，檢測抗體活性。

　　（六）單克隆抗體的大量生產

　　大量生產單克隆抗體的方法主要有兩種：

　　（1）體外使用旋轉培養管大量培養雜交瘤細胞，從一清液中獲取單克隆抗體。但此方法產量低，一般培養液內抗體含量為10～60μg/ml,如果大量生產，費用較高。

　　（2）體內接種雜交瘤細胞，制備腹水或血清。

　　①實體瘤法：對數生長期的雜交瘤細胞按1～3×107/ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml,共2～4點。待腫瘤達到一定大小后（一般10～20天）則可采血，從血清中獲得單克隆 抗體的含量可達到1～10mg/ml。但采血量有限。

　　②腹水的制備：常規是先腹腔注射0.5ml Pristane 降植烷或液體石蠟于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞7～10天后可產生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反復收集數次。腹水中單克隆抗體含量可達到5～10mg/ml，這是目前zui常用的方法，還可將腹水中細胞凍存起來，復蘇后轉種小鼠腹腔則產生腹水塊、量多。

　　（七）單克隆抗體的鑒定

　　對制備的McAb進行系統的鑒定是十分必要的，應做下述幾個方面的鑒定：

　　1．抗體特異性的鑒定 　　除用免疫原（抗原）進行抗體的檢測外，還應該用與其抗原成分相關的其它抗原進行交叉試驗，方法可用ELISA、IFA法。例如：①制備抗黑色素瘤細胞的McAb，除用黑色素瘤細胞反應外，還應該用其它臟器的腫瘤細胞和正常細胞進行交叉反應，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關抗原的單克隆抗體。②制備抗重組的細胞因子的單克隆抗體，應首先考慮是否與表達菌株的蛋白有交叉反應，其次是與其它細胞因子間有無交叉。

　　2．McAb的Ig類與亞類的鑒定　　一般在用酶標或熒光素標記的第二抗體進行篩選時已經基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標或熒光素標記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標準抗亞類血清系統作雙擴或夾心ELISA來確定。在作雙擴試驗時，如加入適量的PEG（3%），更有利于沉淀線的形成。

　　3．McAb中和活性的鑒定　　　用動物或細胞的保護實驗來確定McAb的生物學活性。例如，如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時接種于易感的動物或敏感的細胞，來觀察動物或細胞是否得到抗體的保護。

　　4．McAb識別抗原表位的鑒定　　用競爭結合試驗，測相加指數的方法，測定McAb所識別抗原位點，來確定McAb的識別的表位是否相同。

5．McAb親合力的鑒定　 用ELISA或RIA競爭結合試驗來確定McAb與相應抗原結合的親合力。

ELISA

ELISA是酶聯接免疫吸附劑測定 Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay 的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術之后發展起來的一種免疫酶技術。此項技術自70年代初問世以來，發展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學和醫學科學的許多領域。

　　一　原理

　　ELISA是以免疫學反應為基礎，將抗原、牽9體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。由于抗原、抗體的反應在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應物，從而保證試驗結果的特異性與穩定性。在實際應用中，通過不同的設計，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法圖a、用于檢測抗原的雙抗體夾心法圖b以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。

　　二　操作步驟

　　方法一　用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:

　　1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。簡稱洗滌，下同。

　　2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔。

　　3.　加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體經滴定后的稀釋度0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。

　　4.　加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。

　　5.　終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。

　　6.　結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上，于450nm若以ABTS顯色，則410nm處，以空白對照孔調零后測各孔O·D值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

　　方法二　用于檢測未知抗體的間接法：

　　　　　　用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，
　　　　　　每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　加一定稀釋的待檢樣品未知抗體0.1ml于上述已包被之反應孔
　　　　　　中,置37℃孵育1小時,洗滌。同時做空白、陰性及陽性孔對照

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　于反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體抗抗體0.1ml，
　　　　　　37℃孵育30-60分鐘，洗滌,zui后一遍用DDW洗滌。

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。

　　三　試劑器材

　　1.　試劑

　　1　包被緩沖液PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液:

　　　　　　NaCO３1.59克

　　　　　　NaHCO３　 2.93克

　　　　　　加蒸餾水至1000ml

　　2　洗滌緩沖液PH7.4 PBS：0.15M

　　　　　　KH₂PO₄ 　　　　　0.2克

　　　　　　Na₂HPO_４·12H₂O　　2.9克

　　　　　　NaCl　　　　　　　8.0克

　　　　　　KCl　　　　　　　　0.2克

　　　　　　Tween-20　0.05％　0.5ml

　　　　　　加蒸餾水至1000ml

　　3　稀釋液：

　　　　　　　牛血清白蛋白BSA 0.1克

2.　器材:

　　1　聚苯乙烯塑料板簡稱酶標板40孔或96孔，ELISA檢測儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。

　　2　小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。

　　3　4℃冰箱，37℃孵育箱。

　　四　注意事項

　　1.　正式試驗時，應分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證實驗結果的準確性。有時本底較高，說明有非特異性反應，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

　　2.　在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括:

　　1　固相載體的選擇：許多物質可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一性，據此判明其吸附性能是否良好。

　　（2 包被抗體或抗原的選擇：將抗體或抗原吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時。蛋白質包被的zui適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度0.1、1.0和10μg／ml等進行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值zui大而蛋白量zui少的濃度。對于多數蛋白質來說通常為1～10μg／ml。

　　3　酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定見酶標記抗體部份。然后再固定其它條件或采取“方陣法”包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度在正式實驗系統里準確地滴定其工作濃度。

4   酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無色。有些供氫體如OPD等有潛在的致癌作用，應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后，應加入強酸或強堿以終止反應。通常底物作用時間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H₂O₂在臨用前加入。