激活態多巴胺受體D1R和D2R配體選擇性和G蛋白選擇性機理

發布時間：2021-02-19 15:14 原文鏈接：激活態多巴胺受體D1R和D2R配體選擇性和G蛋白選擇性機理

　　單胺類神經遞質是廣泛分布在人體內的一類化學信號分子，包括多巴胺（dopamine， DA）、腎上腺素（adrenaline）和五羥色胺（serotonin， 5-HT）等，這些信號分子共同調控人體內包括情緒及記憶在內的多種生理功能并維持機體內環境穩態。多巴胺作為人體內一種重要的單胺類神經遞質，通過多巴胺能神經系統，對中樞神經系統（CNS）和外周神經系統（PNS）的功能進行調控。多巴胺能信號主要由人體中一類被稱為多巴胺受體（dopamine receptors， DRs）的G蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptor， GPCR）介導，包括D1R到D5R五個受體成員。按照偶聯下游G蛋白種類的不同，這些受體可進一步分為D1類受體和D2類受體，其中，D1類受體包含D1R和D5R，主要與激活型G蛋白Gs偶聯，刺激下游第二信使環狀單磷酸腺苷（cAMP）的生成；包括D2R、D3R和D4R在內的D2類受體主要與抑制性G蛋白Gi/o偶聯，抑制cAMP形成。在五種DRs中，D1R和D2R是CNS中表達最豐富的受體，主要分布在基底神經節和前額葉皮層中。D1R和D2R介導的多巴胺能信號對獎賞、認知、運動協調和神經內分泌功能等在內的高級腦部功能具有重要意義，其發生異常與一些神經精神疾病密切相關，包括阿爾茲海默癥（Alzheimer's disease， AD）、帕金森氏病（Parkinson’s disease， PD）、精神分裂癥、認知障礙、注意力缺陷多動癥（Attention deficit hyperactivity disorder， ADHD）以及藥物成癮和濫用等。作為多巴胺受體家族的代表成員，D1R和D2R是治療PD及精神分裂癥的熱門藥物靶點。

　　D1R選擇性激動劑長期以來被認為是治療PD的有效方法，但目前上市的D1R激動劑藥物大多是D2樣受體的選擇性激動劑。已開發的D1R選擇性激動劑由于受到代謝快（兒茶酚結構特征）及無法透過血腦屏障等缺陷的影響，尚無通過臨床研究用于神經精神類疾病治療；在治療精神分裂癥中，盡管可以通過目前的藥物作用D2樣受體以有效治療正面癥狀，但它們在減輕負面癥狀和認知缺陷方面效率低下，而D1R選擇性激動劑則可作為精神類疾病患者提高認知的潛在治療途徑。此外，D1R激動劑還被普遍認為是治療AHDH和藥物成癮的有效治療方法。通過對D1R和D2R受體進行結構藥理學研究并揭示其配體選擇性的分子機制，對理解配體結合特性、受體激活和設計更高效的多巴胺受體靶向抗神經精神疾病類藥物具有重要的科學意義和臨床應用價值。

　　目前，盡管已有一些多巴胺受體亞型的結構獲得解析，包括D2R、D3R和D4R與拮抗劑結合復合物的晶體結構以及D2R（突變型）與激動劑復合物的低分辨率冷凍電鏡結構，然而，對于D1類受體，尤其是D1R，自D1R基因被發現及克隆近30年來，其受體結構仍處于未知狀態，這限制了學界對D1R配體識別和受體激活機制的理解，成為制約基于結構的靶向D1R受體藥物研發的重要科學問題。

　　針對上述難題，中國科學院上海藥物研究所研究員徐華強課題組聯合美國匹茲堡大學教授張誠課題組、浙江大學醫學院與浙江省良渚實驗室教授張巖課題組、北卡羅來納大學教堂山分校教授Bryan L. Roth課題組等，應用冷凍電鏡技術（Cryogenic electron microscopy， Cryo-EM）首次解析了帕金森病治療藥物apomorphine（DRs泛激動劑）、D1R/D5R選擇性全激動劑SKF81297以及G蛋白信號偏好性D1R/D5R選擇性部分激動劑SKF83959激活下D1R與下游Gs蛋白復合物的高分辨率冷凍電鏡結構，分辨率為2.9埃-3.0埃。此外，研究人員還解析了帕金森病治療藥物bromocriptine激活下D2R（野生型）與Gi復合物2.8埃分辨率的冷凍電鏡結構（圖1）。這些結構數據結合功能實驗結論揭示了D1R和D2R配體結合口袋的拓撲結構特性、潛在的受體激活機制、配體激動劑選擇性識別并激活D1R和D2R的分子機制、D1R的G蛋白偏好性激活決定因素以及D1R和D2R在G蛋白選擇性差異上的結構基礎等。

　　上述研究成果為以D1R和D2R為藥物靶點的選擇性激動劑藥物的設計和開發，以及G蛋白信號偏好性D1R靶向藥物設計提供了重要的結構基礎和理論依據。相關研究成果以Structural insights into the human dopamine D1R and D2R receptor signaling complexes為題，于2月11日在線發表在Cell上。這是繼2月5日發表在Molecule Cell上關于D3R的工作之后徐華強課題組和張巖課題組等在多巴胺能系統方向進行結構和功能系列研究的又一重要研究進展，進一步加深了學界對該系統的認識。

　　研究發現，D1R在結構上表現為經典的七次跨膜螺旋結構，其中，配體正性結合位點位于受體胞外端，由胞外loop及跨膜螺旋部分組成；Gs蛋白偶聯界面位于受體胞內端，由近胞內端結構域組成。SKF81297、SKF83959及apomorphine均屬于D1R的兒茶酚胺類激動劑，在與D1R的結合上，三種激動劑與受體上結合口袋的相互作用模式類似，其中，最典型的是配體上的氨基與D1033.32之間形成離子相互作用，這個作用位點在所有單胺類受體上極其保守。在結合模式上，三種激動劑的兒茶酚結構朝向TM5，但整體構象存在細微差別，這種細微差別導致不同配體在激活效力及信號通路偏好性的差異。研究人員對比D1R與SKF81297、SKF83959的結構細節發現，雖然SKF83959比SKF81297僅多了兩個甲基，但受到SKF83959結構上azepine環上額外的甲基與D1R上疏水氨基酸F3137.35、W3217.43空間位阻效應影響，相比于SKF81297，SKF83959更接近TM5并限制了TM5向跨膜區中心內移，使SKF83959表現出比SKF81297更弱的激活效力，這與salmeterol部分激活β2AR的原理相似。此外，SKF83959作為D1R的G蛋白偏好性激動劑的機制長期以來未得到解釋，通過結構比對和β-arrestin募集實驗分析，研究人員發現，與SKF83959上azepine環內額外的甲基相互作用的D1R TM5上的氨基酸殘基F2886.51、F2896.52以及TM7上的V3177.39在SKF83959的G蛋白偏好性活性上發揮重要作用，為設計更安全的G蛋白偏好性D1R激動劑提供了結構基礎和理論依據。

　　研究人員對比D1R與非選擇性激動劑apomorphine的結構發現，apomorphine的結合比SKF化合物更遠離D1R的胞外loop 2（ECL2）。進一步比較D1R和D2R的結構，研究人員發現，D1R和D2R的ECL2在拓撲結構上存在明顯差別，D2R的ECL2上的“CIIA”基序相比于D1R的“CDSS”基序更靠近正構結合位點中心，若SKF化合物和apomorphine以類似的模式結合到D2R，D2R的ECL2（尤其是氨基酸殘基I184）將與SKF化合物而不是apomorphine發生空間位阻效應。比較D2R-bromocritine的結構發現，bromocriptine遠離D2R ECL2區域，避免了與之發生位阻效應，這些結果表明ECL2在D1R和D2R的配體選擇性上發揮重要調控作用。Bromocriptine在對D1R的結合力上比D2R大概低50倍。通過D1R和D2R的結構比對發現，D1R的配體結合口袋更狹窄，相比于D2R，D1R的TM6近胞外端往跨膜中心內移5.5埃并與bromocriptine發生一定程度空間位阻，D1R上的非保守的帶正電氨基酸K81在能量上不利于與bromocriptine的結合，這些因素共同決定了bromocriptine對D2R具有更高的親和力（圖2）。

　　雖然D1R與D2R分屬于同一GPCR家族，然而在進化樹分析上D1R與β2AR更接近。與之對應的是，在結構上，D1R和β2AR表現出高度的相似性，尤其是在跨膜區TM5-7、保守的P5.50I3.40F6.44基序及DR3.50Y基序上，這些發現預示D1R和β2AR具有相似的激活機制。同為單胺類受體，D1R和β2AR表現出對不同單胺類神經遞質的選擇性。該研究發現，將D1R TM7上的V317突變成β2AR對應的氨基酸殘基天冬酰胺（N），能夠提高D1R對β2AR選擇性神經遞質腎上腺素及其衍生物異丙腎上腺素的結合效力，表明V3177.39在決定D1R對多巴胺而非其他單胺類神經遞質的選擇性上具有重要意義。

　　在下游G蛋白偶聯上，D1R主要偶聯Gs，D2R主要偶聯Gi，研究人員同時對兩者偶聯下游G蛋白選擇性的機制進行了探索。結果表明，激活態下D1R和D2R的近胞內端結構的構象差異直接引起各自在偶聯下游G蛋白的不同（圖3），這些差異體現在以下三個方面：（1）相比于D2R，D1R TM6的近胞內端外移了8.4埃以容納Gαs上α5螺旋C末端龐大的氨基酸側鏈；D2R近胞內端區域形成的凹腔不足以容納Gαs的C末端復雜的氨基酸側鏈并與之發生空間位阻，但可容納Gαi的C末端較為簡單的氨基酸側鏈，從而導致D1R和D2R對不同G蛋白的選擇性；（2）相比于D2R，D1R的TM5較長，往胞內區更多延伸了2.5個α螺旋并于Gαs的Ras結構域形成進一步的相互作用；（3）相比于D2R，D1R的ICL2多了1個α螺旋，使之與Gαs的Ras結構域形成更強的疏水相互作用網絡。這些因素表明，TM6和α5螺旋等的構象決定D1R和D2R對Gs/Gi的選擇性，這和徐華強團隊在2018年報道的Rhodopsin-Gi結構通過分子動力學模擬揭示的Gs/Gi選擇性機制相符合。

　　綜上，研究人員通過解析選擇性D1R激動劑、非選擇性多巴胺受體激動劑激活下D1R-Gs和D2R-Gi復合物的結構，結合功能試驗數據，闡釋了D1R和D2R在配體選擇性和G蛋白選擇性識別上的機制等重要的生物學問題，為開發以D1R和D2R為靶標的選擇性藥物、更安全的抗神經精神疾病類藥物提供了重要的結構和理論基礎。