真核細胞總RNA的制備（TotalRNAIsolation）1

從細胞中分離RNA的純度于完整性對于許多分子生物學實驗至關重要。如Northern印跡與雜交分析、寡聚（dT）纖維素選擇分離 mRNA，cDNA合成及體外翻譯等實驗的成敗，在很大程度上決定于RNA的質量。
RNA分離的最關鍵因素是盡量減少RNA酶的污染。
快速一步法提取總RNA
組織及有核細胞在勻漿過程中被變性液破膜、溶解，變性劑抑制RNA酶的活性，并使蛋白質變性及與核酸分離。經酸酚/氯仿將RNA抽提至水相，與DNA和蛋白質分離，再經異丙醇沉淀回收總RNA。
【試劑】
1×CSB緩沖液： 檸檬酸三鈉 25mmol/L pH7.0
十二烷基肌苷酸鈉 0.5%
b- 巰基乙醇 0.1mol/L
配制100ml 5×CS緩沖液：檸檬酸三鈉3.6762，十二烷基肌苷酸鈉 2.5g溶于100ml 0.05％DEPC水中，過濾，15lb/in2， 20min，去DEPC，4°C保存。
用前100ml工作液加 b-巰基乙醇700ml。
4mol/L異硫氰酸胍變性緩沖液：
47.26g異硫氰酸胍加至100ml CSB緩沖液中。
配制：23.63g異硫氰酸胍加熱65°C溶于20ml無RNase水中，加10 ml 5×CS，加350ml b-巰基乙醇，用無RNase的水定量至 50ml。（約加25ml水）
2mol/L 乙酸鈉NaAc（pH4.0）：
16.4g乙酸鈉加至0.05％DEPC水40ml，用冰乙酸調pH至4.0，定容至100ml，分裝，高壓20min去除DEPC。
3mol/L 乙酸鈉NaAc (pH5.2):
24.6g 乙酸鈉加至0.05％DEPC水80ml，用冰乙酸調pH至5.2，定容至100ml，分裝，高壓20分鐘去除DEPC。
水飽和酚（酸酚，pH4.0）：
取重蒸酚200ml，于65°C水浴溶解，加100ml無RNase水混勻，靜置，取上層水相（大部分），加 0.2g 8-巰基喹啉，混勻，保存于棕色廣口瓶，4°C待用。

【操作方法】
1． 組織勻漿：新鮮的或液氮凍存的組織，稱重后，按100mg組織/ml變性液，勻漿。置冰上30min。
培養細胞：貼壁細胞用PBS洗2次后，直接加2ml變性緩沖液/瓶；懸浮細胞用PBS洗沉淀2次，按107細胞/ml變性緩沖液，置冰上30min。
2． 取0.5ml粘稠液體加入1.5ml Eppendorf 管（10ml塑料離心管）中，加50ml （1/10體積）2 mol/L NaAc（pH4.0），混勻。
3． 加0.5ml(等體積)酚和100ml (1/10體積的)氯仿：異戊醇（49:1），振蕩混勻，冰浴10min。
4． 4°C，12000g，20min。
5． 吸上層水相入新管，加等體積異丙醇，-20°C，至少1hr。
6． 4°C，12000g，20min。
7． 棄上清，沉淀用 1ml預冷的70%乙醇漂洗，并移入Eppendorf管。
8． 4°C，12000g，10min。
9． 棄上清，室溫干燥蒸發殘存乙醇，數分鐘。
10．加100ml 水溶解RNA，測含量。
11．加1／10體積3mol乙酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積預冷的無水乙醇置-30℃30min。
12．離心，12000g，15min．
13．棄上清，加預冷的70％乙醇 1ml，12000g，離心5min。棄上清，室溫放置數分鐘。
溶解RNA：每20mg RNA加4.5ml水溶解RNA，4℃存放待轉膜（不宜久放）。